Стимуляція росту амніоцитів одночасно зі зниженням витрат та часу, необхідних для культивування амніотичної рідини. Умови отримання хромосомних препаратів високої якості з культури клітин амніотичної рідини. Використання трансабдомінального амніоцентезу.
Аннотация к работе
Одною з важливих задач медичної генетики є профілактика хромосомних захворювань, які мають значну питому вагу в структурі причин дитячої смертності та інвалідності. Актуальність проблеми посилюється високою популяційною частотою хромосомних синдромів, які виявляються у 7 з 1000 живонароджених дітей [Бариляк І.Р., Гнатейко О.З., 1991]. Ефективність пренатальної діагностики (ПД) хромосомних захворювань залежить, головним чином, від рішення двох питань - формування груп ризику, в яких проводяться інвазивні дослідження, та вибору методів, що використовують для цитогенетичної ПД. Враховуючи те, що переважна більшість хромосомних синдромів відносяться до мутацій «de novo», тільки розробка чітких критеріїв та ретельний відбір вагітних при призначенні інвазивної ПД може підвищити ступінь виявлення хромосомної патології водночас із зниженням обсягу виконуваних діагностичних маніпуляцій. Використання традиційного показання для проведення інвазивних досліджень - вік жінки більше 35 років - не може суттєво вплинути на популяційну частоту хромосомних захворювань в Україні, тому що кількість літніх вагітних не перевищує 9% [Arbuzova S.B., 1997].
Список литературы
З теми дисертації опубліковано 11 робіт, в тому числі 6 журнальних статей.
Об?єм та структура роботи.
Дисертаційна робота викладена на 137 сторінках машинописного тексту у вигляді 5 розділів і складається з вступу, огляду літератури, опису обєкту та методик дослідження, розділів власних досліджень, обговорювання результатів, висновків та списку літератури. Текст дисертації ілюстрований 15 таблицями та 20 малюнками. Список літератури містить 196 назв.
ЗМІСТ РОБОТИ культивування амніотичний хромосомний трансабдомінальний
Матеріали та методи дослідження.
Комплексна пренатальна діагностика здійснювалася в Донецькому ММГЦ. Формування потоків на інвазивні дослідження виконувалося на підставі даних анамнезу, результатів цитогентичних досліджень, ультразвукового та біохімічного скринінгів.
Ультразвуковий скринінг проводився за схемою, запропонованою Гречаніною О.Я. (1992).
При аналізі маркерів материнської сироватки (МС) використовувалися розроблені базові та граничні значення альфа-фетопротеіну (АФП) та хоріонічного гонадотропіну (ХГ) для кожного тижня вагітності та їх зміну при хромосомних порушеннях у плода [Николенко М.И., 1997]. Комбінований ризик розраховували згідно принципу Wald і Cuckle (1988).
Для інвазивної ПД переважно використовувався трансабдомінальний амніоцентез. Основою для проведення досліджень стало удосконалення традиційного способу отримання хромосомних препаратів з культури АР. Модифікована методика була опрацьована на 150 культурах паралельно з культивуванням і фіксацією АР за класичною методикою [Nadler, 1969; Gregson, 1970; Nelson, 1973].
Усього проведено 1603 амніоцентеза, 104 плацентоцентеза і 11 кордоцентезів. Аспірація матеріалу для інвазивних досліджень проводилась у терміні вагітності 14-25 тижнів під контролем ультразвукового сканеру Aloka - SSD 630.
Для оцінки хромосомного набору в клітинах плаценти аналізували препарати, виготовлені «напівпрямим» методом [Кулешов Н.П., 1989].
Культивування пуповинної крові плода та периферичної крові батьків проводили за загальновизнаною методикою [Hungerford D., 1965], використовуючи запропонований нами спосіб синхронізації мітозів в культурі - до початку фіксації культуру лімфоцитів витримували 2-2,5 години у термостаті з температурою 36 °С.
Для отримання диференційного забарвлення хромосом, оцінки розмірів гетерохроматинових та ядерцеутворюючих районів використовували G-, C- і Ag- методи [Селезнев Ю.В., 1972; Sumner, 1971; Bloom, 1976].
Математична обробка результатів виконувалась на комп?ютері ІВМ PC/AT 486 з використанням програми STATGRAPHICS версії 3.0; Excel 5.0; SAS версії 6.04.
Були встановлені чинники, які впливають на тривалість культивування амніоцитів та якість хромосомних препаратів.
Практично в усіх існуючих на сьогодні методиках наступним за аспірацією АР проводять етап центрифугування отриманої рідини з метою відокремлення ембріональних клітин від іншої суміші. Під час центрифугування клітини можуть пошкоджуватися; крім того, при відокремленні надосадової рідини відбувається їх часткова втрата. Таким чином, в цій пробі АР первісно знижена проліферативна активність амніоцитів.
При усуненні етапу центрифугування АР, який виступає перед ставленням культури, через 72 години після початку культивування на дні флакону було відмічено значну кількість прикріплених до субстрату клітин. Крім того, до цього часу у 75% культур були сформовані колонії діаметром 2-3 мм. В паралельній культурі, де АР підлягала центрифугуванню, за аналогічний проміжок часу кількість прикріплених до культуральної поверхні клітин була значно меншою.
Важливим чинником, який сприяє скороченню часу культивування, є використання експериментально дібраних комплексних живільних сумішів, до яких входять синтетичні середовища Hams F-10, Hams F-12, RPMI - 1640, а також ембріональна теляча сироватка (ЕТС) (80 та 20%, відповідно). При культивуванні АР на загальновизнаному середовищі Changs, спеціально призначеному для стимуляції вялоростучих клітин та ліній [Chang H., 1991], і комплексній живильній суміші, часових відмін не відзначено. Крім цього, вартість середовища Changs майже в 10 разів перевищує вартість комплексного середовища.
Важливою перевагою запропонованої методики є те, що вона не потребує використання СО2- інкубатора для культивування клітин АР, так як підібраний склад сумішів, до яких входить HEPES, дозволяє підтримувати оптимальний рівень кислотності (7.2-7.4). Відсутність СО2-інкубатора часто виступає перешкодою використанню амніоцитів для цитогенетичної ПД, тому що всі традиційні методики адаптовані саме до цієї умові культивування клітин АР.
Ще одним культуральним заходом, який впливає на термін культивування, якість хромосомних препаратів та вартість обстежень, є зміна живильної суміші не раніше 5-6 доби. Наші дослідження довели, що, на відміну від класичних методик, немає потреби кожні 3-4 дні проводити зміну живильної суміші, тому що середовища складені з великим запасом поживних речовин, і на протязі зазначеного періоду часу вичерпання їх не відбувається. Першу зміну живильного субстрату проводили за 16-18 годин до початку фіксації, синхронізуючи мітотичний розподіл клітин в культурі. Завдяки цьому, вдалося збільшити мітотичний індекс у 2-2,5 рази порівняно з аналогічною пробою АР, зафіксованою традиційним способом. Двократну зміну живильного середовища - на 5 добу та за 16-18 годин до початку фіксації - проводили лише в культурі з низькою проліферативною активністю.
Таким чином, внаслідок проведеної роботи, була запропонована удосконалена методика культивування та фіксації амніоцитів, що дозволяє протягом 7-9 діб, на відміну від класичної, яка потребуї 15-18 діб, отримати хромосомні препарати високої якості з 25-30 метафазами на склі (табл. 1, мал.1).
Таблиця 1
Якісно-часова характеристика традиційної то модифікованої методик
Методика, яка використовується Період адгезії, доби Період відновлення мітотичної активності, доби Період формування диференційованого монослою, доби Кількість метафаз на одному склі
Традиційна 5 5-8 15-18 10-15
Модифікована 3 3-5 7-9 25-30
Запропонована методика була апробована на паралельних культурах АР, яку аспірували в різних термінах вагітності. Часових відмін при культивуванні АР, отриманої з 16 по 25 тижні, не помічено. В процесі роботи з АР, яка була аспірована до 16 тижня, встановлено, що час культивування складас в середньому 14 діб. Тому, виконуючи ранні амніоцентези, для скорочення періоду культивування АР пропонується збагатити живільну суміш середовищем IMDM.
Обгрунтування переважного використання трансабдомінального АЦ для цитогенетичної ПД.
Головною перевагою трансабдомінального амніоцентезу є його безпечність, що продемонстровано усіма дослідниками та було показано у нашій роботі. Ризик переривання вагітності після проведення цієї інвазивної маніпуляції, згідно з літературними даними, не перевищує 0,5-0,7% [Бочков Н.П., 1982; Tabor A., 1988; Mennuti M.,1989]. З 1603 діагностичних АЦ, проведених в ММГЦ м. Донецька, перериванням вагітності закінчилися 4 інвазивні маніпуляції, що склало 0,2% від загальної кількості обстежених. В одному з цих випадків була виявлена хромосомна патологія плода - трисомія 21.
Застосовуючи модифіковану методику, яка дозволяє отримати високоякісні хромосомні препарати при зниженні строків культивування АР, діагностичний амніоцентез виконувався як головний метод інвазивної діагностики хромосомних захворювань.
Як додаткові методи ми використовували плаценто- та кордоцентез. До методу кордоцентезу зверталися в крайніх випадках, що пояснюється складністю виконання та високим ризиком ускладнень після даної інвазивної маніпуляції [Кулиев А.М.,1990; Nicolaides K., 1986]. В наших дослідженнях кордоцентез виконувався з метою верифікації діагнозу, а також при значному маловодді - коли аспірація навколоплодної рідини була неможлива.
Плацентоцентез проводили у випадках пізнього звертання жінки до МГЦ (у терміні вагітності 23-25 тижнів), в тому числі, при виявленні в цих строках УЗ-ознак хромосомної патології плода. Практично єдиною перевагою плоцентоцентезу були малі терміни субінкубування (2,5-3 години) отриманого біоптату. Провести якісний хромосомний аналіз у клітинах біоптату плаценти вдалося у 71% випадків. Невдачі при аналізі каріотипу в решті випадках були зумовлені наявністю великої кількості гіпоплоїдних пластинок внаслідок втрати хромосом під час мацерації тканини оцтовою кислотою (10,6%), низькою якістю хромосомних пластинок (10,7%), відсутністю метафаз на готових препаратах (4,8%) та малим об?ємом аспірованої тканини (2,9%). З аналогічними проблемами зустрічаються й інші дослідники, відмічаючи також і більш високий ризик ускладнень після даної маніпуляції у порівнянні з трансабдомінальним амніоцентезом [Кулешов Н.П., Барцева О.Б., 1989; Wapner R., Jackson L., 1988].
Паралельно з плацентоцентезом виконували амніоцентези. Клітинну масу, потрібну для фіксації, отримували через 7-9 діб. З усіх проб АР були виготовлені високоякісні хромосомні препарати.
Суттєвою вадою плацентоцентезу є висока частота тканинного мозаїцизму, який реєструють, аналізуючи препарати з біоптату плаценти. В наших дослідженнях вона складала 5,4%, хоча в літературі вказують і більш значне число відсотків. Так, при цитогенетичному аналізі клітин плаценти у 4 випадках були відзначені хромосомні порушення: трисомія по хромосомах 21 (2 випадки) та маркерних хромосомах (mar = G та mar < E).
Тканинний мозаїцизм в АР практично не зустрічається [Bui T. et al., 1984; Worton R., 1984]. Аналізуючи хромосомні препарати, виготовлені з культури амніоцитів, ми зіткнулися лише з явищем помилкового (культурального) мозаїцизму, частота якого склала 2,9%, що узгоджується з літературними даними [Masis A., 1986; Krawczun M., 1989; Jha A., 1992].
Порівняння діагностичної значущості описаних методів демонструє перевагу трансабдомінального АЦ, безперечними і головними якостями якого є мінімальний ризик ускладнень, висока інформативність, а також найменше число відсотків мозаїцизму.
Виявлення хромосомної патології плода в різних групах генетичного ризику
В ході комплексної ПД різноманітний спектр хромосомних та геномних порушень в каріотипі плода був виявлений у 8% обстежених. В структурі геномних патологій значна питома вага належала синдрому Дауна - 41,5%, синдрому Едвардса - 15,1% та синдрому Тернера - 15,1% (мал. 2).
Таблиця 2
Ступінь виявлення хромосомних порушень в каріотипі плода в різних групах генетичного ризику
Група ризику Кількість амніоцентезів абсолютне / % Кількість плодів з хромосомними порушеннями абсолютне / %
Вік матері більше 35 років 324/20,2 6/1,85
Високий комбінований ризик через вік матері (більше 35 років) та ОАА 141/8,8 6/4,26
Високий комбінований ризик через вік матері (більше 35 років) та рівень маркерів МС 242/15,1 33/13,60
Дитина з синдромом Дауна в анамнезі 128/8,0 1/0,78
Дитина з ПВР в анамнезі 55/3,4 -
Змінений рівень маркерів МС (вік матері менше 35 років) 579/36,1 55/9,50
Наявність хромосомної перебудо-ви в каріотипі батьків 30/1,9 15/50,0
Виявлені УЗ-маркери хромосомної патології 86/5,4 6/7,0
Захворювання, зчеплені зі статтю 18/1,1 -
Ступінь виявлення хромосомних аберацій плода варіювала в різних групах ризику і залежала від принципів їх формування.
Аналіз ефективності виявлення хромосомних патологій в трьох групах вагітних віком понад 35 років показав, що з 324 жінок, яким діагностичний АЦ був призначений тільки з причин віку, хромосомні порушення в каріотипі плода були виявлені лише у 6 обстежених, що склало 1,85%.
В другу групу літніх вагітних віднесені жінки з обтяженим акушерським анамнезом (ОАА), тобто наявністю спонтанних викиднів, тривалого безпліддя, порушень менструального циклу. В даній групі, сформованій на підставі врахування декількох показників, хромосомні аберації плода були виявлені у 6 з 141 обстеженої (4,26%).
Третю групу вагітних, направлених на інвазивну ПД, склали жінки, віком 35 років і більше, зі зміненим рівнем АФП і ХГ. Загальна кількість літніх жінок, обстежених на маркери МС складала 1970. На підставі результатів біохімічного скринінгу в групу ризику були віднесені лише 242 вагітні. Хромосомні порушення у плода виявлені у 33 обстежених, що склало 13,6%. Аналіз катамнестичних даних показав, що серед жінок віком понад 35 років, яким АЦ не був призначений, не зареєстровано випадків народження дитини з хромосомними захворюваннями. Таким чином, завдяки використанню скринінгу маркерів МС та диференційованому підходу до формування груп ризику, вдалося значно підвищити ступінь виявлення хромосомної патології одночасно з різким зниженням кількості інвазивних обстежень серед жінок старшого віку.
Традиційним показником до призначення діагностичного АЦ, крім віку матері, є наявність дитини з СД в анамнезі. Однак, за даними літератури, ризик повторного народження дитини з хромосомною патологією, зокрема з трисомісю 21, не перевищує 1% [Milunsky A., 1979; Stene J. et al., 1984], що було підтверджено в ході нашого дослідження. Так, в результаті проведення цитогенетичної допологової діагностики 128 жінкам цієї групи, хромосомна патологія була виявлена лише у одного плода - 46, del(X) / 45, X0 - мозаїчна форма синдрому Тернера. Крім того, в 3-х випадках були діагностовані дефекти невральної трубки плода. Тобто, хоча ці жінки і відносяться до групи високого ризику, він не завжди повязаний з імовірністю народження дитини з хромосомною патологією. До цієї групи вагітних так само, як і до групи жінок, що мають в анамнезі дитину з природженими вадами розвитку (ПВР), треба використовувати диференційований підхід, враховуючи дані ультразвукового та біохімічного скринінгів при призначенні інвазивних досліджень.
Особливо актуальним є розрахунок індивідуального ризику з використанням рівня маркерів МС у жінок віком до 35 років. Завдяки масовому скринінгу вагітних на маркери МС, питома вага жінок цієї групи в структурі направлянь на АЦ склала 36,1%. Хромосомні порушення в каріотипі плода були виявлені у 9,5% випадків.
Показаннями до проведення діагностичного АЦ, які не потребують додаткового розрахунку індивідуального ризику, є наявність в каріотипі батьків геномних анеуплоїдій або хромосомних перебудов. В даній групі хромосомні порушення у плода були виявлені в 50% випадках, представлені в 36,7% сбалансованими транслокаціями, успадкованими від батьків і в 13,3% - несбалансованими.
Діагностичний АЦ проводили і тим жінкам, у котрих при ультразвуковому дослідженні (УЗД) плода в 2-му триместрі були виявлені специфічні для хромосомної патології маркери: шийна цистогігрома, збільшення розмірів шийної складки, пієлоектазія, гастромегалія, скорочення довжини стегна, порушення об?єму навколоплодної рідини. Хромосомні захворювання в цій групі діагностовані у 3-х плодів з шийною цистогігромою, каріотип - 45,X0. Проведені дослідження узгоджуються з літературними даними, згідно яких інформативність УЗ- маркерів в 2-му триместрі не така значна, щоб вплинути на популяційну частоту хромосомної патології [Brombati B., 1995; Orlandi F., 1997]. Згідно останніх даних, найбільш інформативним УЗ-маркером визнано комірцевий простір плода (nuchal transluency) в 1-му триместрі вагітності. Збільшення його розміру понад 2,5 мм в 85% випадків сполучується з трисомією 21 [Nicola1des K.,1992; Brizot M., 1995]. Такі зміни спостерігалися нами в 3-х випадках, в одному з яких діагностований СД.
Результати проведеного порівняльного аналізу ступеня виявлення хромосомних порушень вказують на необхідність використання диференційованого підходу до оцінки індивідуального ризику при призначенні інвазивної ПД.
Отримані дані лягли в основу запропонованої схеми формування груп ризику для проведення інвазивних досліджень, в якій взаємозв?язок та спадкоємність методів комплексної ПД дозволяють підвищити ефективність виявлення хромосомних патологій плода (мал. 3).
Таким чином, підсумком проведеної роботи є розробка модифікованої методики отримання хромосомних препаратів високої якості з культури клітин амніотичної рідини, яка дозволяє широко використовувати діагностичний амніоцентез для пренатальної діагностики хромосомних захворювань, та удосконалення підходів до формування груп високого генетичного ризику.
ВИСНОВКИ
1. Отримання хромосомних препаратів високої якості з культури клітин амніотичної рідини при зниженні витрат та часу, потрібних для проведення досліджень, підвищує діагностичну значущість амніоцентезу, який являється найбільш безпечним та інформативним методом пренатальної діагностики хромосомних захворювань.
2. Усунення етапу центрифугування АР до ставлення її в культуру та використання комбінації середовищ RPMI - 1640; Hams F-10; Hams F-12 з доданням HEPES скоротшує час культивування амніоцитів до 7-9 діб, а також не вимагає застосування спеціалізованих дорогих сумішів та СО2-інкубатора.
3. Синхронізація мітотичного розподілу амніоцитів в культурі за 16-18 годин до початку її фіксації дозволяє отримати хромосомні препарати з 25-30 метафазами на склі.
4. Запропонована методика дозволяє отримати культуру клітин АР незалежно від термінів вагітності, на яких вона аспірована. Для скорочення періоду культивування АР, яка отримана раніш 16 тижня вагітності, до 9-10 діб, необхідно додаткове збагачення живильної суміші середовищем IMDM.
5. Перевагою використання АЦ в 2-му триместрі вагітності є можливість більш старанного відбору груп високого ризику, що дозволяє підвищити ступінь виявлення хромосомної патологі при зниженні кількості проведених маніпуляційї .
6. Висока ефективність виявлення хромосомної патології плода, незалежно від віку жінки, досягається розрахунком індивідуального ризику, заснованому на комплексній оцінці результатів біохімічного скринінгу, даних УЗД та анамнезу.
Список опублікованых наукових робіт, які відображають основні положення дисертації
Арбузова С.Б., Хлевная Л.А., Казначеева Е.Б., Николенко М.И. Формирование групп риска и проведение инвазивной пренатальной диагностики // Цитология и генетика. - 1995. - Т.29, № 5. - С. 76-81.
Арбузова С.Б., Николенко М.И., Хлевная Л.А. и др. Пренатальная диагностика синдрома Дауна на основе биохимического скрининга маркеров материнской сыворотки // Цитология и генетика. - 1998. - Т.32, № 1. - С. 66-71.
Арбузова С.Б., Николенко М.И., Хлевная Л.А. и др. Динамика биохимических маркеров материнской сыворотки при различных хромосомных нарушениях плода // Цитология и генетика. - 1998. - Т.32, № 5. - С. 75-79.
Арбузова С.Б., Хлевная Л.А., Малова С.А. Усовершенствованная методика культивирования и фиксации амниоцитов человека // Биополимеры и клетка. - 1998. - Т.14, № 6. - С. 559-560.
Хлевная Л.А. Дифференцированный подход к формированию групп риска для проведения инвазивных исследований // Вопросы экспериментальной и клинической медицины.: Сб. статей. Донецкий Гос. мед. университет. - Донецк, 1997 - С. 179-181.
Арбузова С.Б., Ніколенко М.І., Малова С.А., Хлівна Л.А., Дружиніна О.М. Формування потоків для проведення пренатальноі діагностики в Донецькому міжобласному медико-генетичному центрі // Матеріали другого зізду медичних генетиків України. Львів, 1995. - С. 8.
Арбузова С.Б., Хлівна Л.А. Удосконалення класичноі методики культивування та фіксаціі амніоцитів // Матеріали другого зізду медичних генетиків України. Львів, 1995. - С. 9.
Хлівна Л.А. Випадок постійного маркеру у здоровоі жінки. Матеріали 1-го Конгресу Украінськоі Асоціаціі спеціалістів ультразвуковоі діагностики в перинатологіі, генетиці та гінекологіі. Харків, 1997. - С. 37-38.
Хлевная Л.А. Диагностика хромосомных заболеваний в межобластном медикогенетическом центре г. Донецка // Актуальные проблемы медицины Донбасса: Тез. науч. тр. молодых ученых и специалистов. Донецк, 1997. - С. 79-80.
Arbuzova S., Nickolenko M., Khlevnaya L., Fedotova O. Complex prenatal diagnosis in Donetsk interregional medico-genetic centre // Abstracts of 2nd PECO-EUCROMIC Congress, 1997. - P. 46.
Arbuzova S., Nickolenko M., Khlevnaya L., Prenatal diagnosis of Downs syndrome in the Donetsk region of the Ukraine // Cesko-Slovenska Pediatrie, 1997. - N 7 (Special Issue). - P. 510-511.