Определение физико-химических параметров неконтактно электрохимически активированных вод, существенных для обеспечения генетической безопасности. Анализ методики оценки потенциальной генотоксичности активированных питьевых вод по материалам исследований.
Аннотация к работе
Вопрос об оценке безопасности неконтактно электрохимически активированных вод ранее не поднимался: считалось, что если - в соответствии с регламентами применения электрохимических активаторов питьевой воды - в прибор поступает вода, удовлетворяющая условиям САНПИН по химическому составу, то после активации вода также должна соответствовать этим требованиям. Исходя из этого, целью работы является оценка генетической безопасности питьевых вод, полученных неконтактной (электрохимической) активацией, и создание минимального набора тестов для проведения рутинных исследований активированных вод на наличие генотоксической активности. впервые установлено, что генотоксические эффекты, индуцированные неконтактно активированными католитами и анолитами, полученными одной и той же питьевой воды, принципиально различались по ассоциации с физико-химическими свойствами НАВ: католиты - со светосуммой люминол-геминовой хемилюминесценции воды (СХЛ), а анолиты - со значениями ОВП и РН активированных вод; Для оценки генетической безопасности питьевых вод, полученных неконтактной электрохимической активацией, выделены наиболее информативные тест-объекты: клетки крови человека, культивированные в условиях цитокинетического блока с цитогенетическим анализом в расширенном варианте микроядерного теста, и клетки костного мозга мышей с цитогенетическим анализом в тесте на индукцию хромосомных аберраций. Результаты исследования доложены и обсуждены на: 8-м международном симпозиуме «Экология человека и медико-биологическая безопасность населения», Венгрия-Австрия, 20-29 октября 2012; Международном водном форуме Экватек 2012 «Вода, экология и технология» (секция «Энергоинформационные технологии»), Москва, 5-6 августа 2012; XVIII-м Всероссийском конгрессе “Экология и здоровье человека», Самара, 8-10 октября 2013; IV-м съезде токсикологов России, Москва, 6-8 ноября 2013; VIII Всероссийском форуме «Здоровье нации - основа процветания России», Москва, 18-20 июня 2014; пленумах Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ «Актуализированные проблемы здоровья человека и среды обитания и пути их решения» 12-13 декабря 2012 и «Приоритеты профилактического здравоохранения в устойчивом развитии общества: состояние и пути решения проблем», Москва, 12-13 декабря 2013; IV-й Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье.Как видно, в средах на всех НАВ наблюдалось торможение пролиферации клеток, что, преимущественно, выражалось в увеличении доли неделящихся (одноядерных) клеток и в снижении доли ускоренно делящихся (содержавших более 2 ядер) клеток в спектре клеточных популяций. В этих экспериментах суммарная частота клеток с повреждениями (МЯ и НПМ) была значимо выше контроля (ОВП 325,9МВ) только в культуре на анолите (ОВП 360,8 МВ), а в некоторых средах на католитах, наоборот, наблюдалось снижение частоты клеток с МЯ и НПМ (рис.2А), митотической активности и апоптоза (рис.2Б). Эти эффекты, преимущественно, проявились в повышении частоты 2-ядерных клеток с повреждениями (рис.2Г) и увеличении числа клеток в состоянии апоптоза. Противоположными для католитов и анолитов оказались корреляции между основными цитогенетическими показателями - частотой делящихся клеток с генетическими повреждениями и объемом пролиферативного пула (рис.3). Результаты этого эксперимента показали, что инкубация клеток в среде на основе католита, активированного в течение 5 мин, приводила к увеличению пролиферативного пула, повышению частоты 3-ядерных клеток и частоты ускоренно делящихся клеток с повреждениями.При неконтактной (электрохимической) активации питьевая вода различного происхождения и солевого состава может приобретать генотоксическую активность, которая проявляется на различных живых тест-объектах, в основном, как изменение митотической / пролиферативной активности, изменение частоты клеток с генетическими повреждениями и частоты клеток в состоянии апоптоза. Культивирование в реконструированных средах на основе НАВ повышало чувствительность генома лимфоцитов крови человека к действию стандартного мутагена МННГ, что, преимущественно, проявлялось в увеличении частоты клеток в состоянии апоптоза и доли клеток 2 митоза с асимметричным распределением генетического материала. Влияние минерализации на частоту генетических повреждений, индуцированных НАВ на культуре лимфоцитов крови человека (повышение частоты апоптоза, r = 0,74 и снижение частоты ускоренно делящихся клеток с повреждениями, r = - 0,92) выявлено только у католитов. С увеличением продолжительности неконтактной активации значительно снижалась пролиферативная активность лимфоцитов крови человека, культивированных в реконструированных средах на основе НАВ: увеличивалась доля неделящихся (1-ядерных) клеток и уменьшалась численность фракций делящихся клеток, эти изменения особенно были ярко выражены в культурах на анолитах. В динамике подострого эксперимента на мышах показано, что через сутки после начала выпаивания католитами, пригото
Вывод
Для исключения влияния солевого состава на потенциальную генотоксическую активность НАВ на первом этапе работы изучали эффекты осмотической воды in vitro.
На рис.1 показаны результаты анализа пролиферативной активности культивированных в реконструированных средах клеток крови человека. Как видно, в средах на всех НАВ наблюдалось торможение пролиферации клеток, что, преимущественно, выражалось в увеличении доли неделящихся (одноядерных) клеток и в снижении доли ускоренно делящихся (содержавших более 2 ядер) клеток в спектре клеточных популяций. Степень выраженности эффекта линейно зависела от силы тока при электролизе (особенно при часовой экспозиции), но не от овп.
.
Рисунок 1. Изменение спектра клеточных популяций в культурах крови человека, культивированных в средах на осмотической воде в зависимости от режима активации.
Нижняя шкала абсцисс - ОВП (МВ)
Обозначения: К - католиты, А - анолиты; 20,40,60 - сила тока при получении контактных католитов и анолитов; час, сут - продолжительность активации НАВ
В этих экспериментах суммарная частота клеток с повреждениями (МЯ и НПМ) была значимо выше контроля (ОВП 325,9МВ) только в культуре на анолите (ОВП 360,8 МВ), а в некоторых средах на католитах, наоборот, наблюдалось снижение частоты клеток с МЯ и НПМ (рис.2А), митотической активности и апоптоза (рис.2Б).
Рисунок 2. Основные эффекты нестабильности генома лимфоцитов крови человека в зависимости от режимов получения и ОВП НАВ: А - суммарная частота клеток с МЯ и НПМ (%); Б - митотическая активность и частота апоптоза; В - доля 3-ядерных клеток среди всех клеток, прошедших в присутствии ЦХВ два митотических цикла; Г - частота двуядерных клеток с повреждениями в присутствии МННГ. Примечание: *) на рисунках А,Б и В - р? 0,05 относительно контроля; на рис. Г показаны значимые различия с пробами воды, необработанными МННГ.
Важно, что во всех католитах вне зависимости от значений ОВП доля 3-ядерных клеток, образовавшихся в результате асимметричного распределения генетического материала во втором митотическом цикле, была выше уровня контроля (рис.2В). Нагрузка культур крови человека разными концентрациями стандартного мутагена показала, что активация воды повышала чувствительность генома к действию стандартного мутагена МННГ. Эти эффекты, преимущественно, проявились в повышении частоты 2-ядерных клеток с повреждениями (рис.2Г) и увеличении числа клеток в состоянии апоптоза.
Противоположными для католитов и анолитов оказались корреляции между основными цитогенетическими показателями - частотой делящихся клеток с генетическими повреждениями и объемом пролиферативного пула (рис.3). Поэтому в дальнейших исследованиях эффекты анолитов и католитов анализировали раздельно.
Рисунок 3. Зависимость частоты делящихся клеток с повреждениями от пролиферативного пула при культивировании клеток крови человека в реконструированных средах на НАВ (без и в присутствии МННГ ).
Таким образом, результаты 1-го этапа исследования выявили наличие генотоксической активности у различных НАВ вне зависимости этих эффектов от ОВП, что потребовало систематического изучения этих вод на живых моделях разного уровня. Для дальнейшего изучения эффектов неконтактной активации представлялось целесообразным: Использовать изученный широкий диапазон значений ОВП (от - 60 до 360 МВ);
Для получения неконтактно активированных католитов эффективна короткая (не более 60 мин) экспозиция в контактно полученных водах, полученных при максимальной силе тока (60 МА);
Изучить генотоксические эффекты НАВ на основе водопроводной воды, поскольку именно эта вода наиболее вероятно может использоваться в бытовых активаторах.
Для контактно электрохимически активированных вод неоднократно была описана бактерицидная активность (Леонов Б.И. и др, 1999; Бахир В.М. и др. 2001, Каврук Л.С.и др, 2004; Kiura et al, 2002). Для НАВ такие сведения в литературе отсутствуют, поэтому на следующем этапе работы изучали влияние НАВ на жизнеспособность бактерий кишечной флоры человека. Для работы использовали бактерии с разнонаправленной активностью: музейный штамм E.coli 1257 как модель патогенной микрофлоры и B.cereus IP 5832 из аптечного препарата Бактисубтил.
Результаты экспериментов показали, что для обоих штаммов бактериостатическое действие нелинейно изменялось при изменении ОВП НАВ, причем этот эффект наблюдался как в осмотической, так и в водопроводной воде. Эти эксперименты выявили существенную нестабильность ОВП воды Самарского водопровода и НАВ на ее основе при постоянных условиях активации в близкие календарные сроки, а также вариабельность жизнеспособности бактерий, инкубированных в этих НАВ (рис.4). Аналогично, существенно нелинейные зависимости были получены при инкубации бактерий в НАВ на основе осмотической воды.
Рисунок 4. Воспроизводимость результатов экспериментов по оценке жизнеспособности E.coli 1257 при 24 часовой инкубации в НАВ на основе воды из самарского водопровода
Таким образом, анализ влияния НАВ на жизнеспособность как патогенных микроорганизмов, так и бактерий, используемых для восстановления кишечной флоры, выявил нелинейные и плохо воспроизводимые как бактериостатические, так и биостимулирующие эффекты для обоих использованных штаммов.
Поскольку для неконтактной активации в быту чаще всего может быть использована водопроводная вода, следующая серия экспериментов была проведена на НАВ на основе воды из московского водопровода.
Результаты химического анализа показали, что по абсолютному большинству показателей все образцы неконтактно активированной воды не отличались от исходной, в которой содержание всех выявленных соединений не превышало долей ПДК для питьевых вод. Исключение составили неидентифицированные фталаты, содержание которых в католите, активированном при максимальной экспозиции, и в анолите, было значительно выше контроля.
Одним из наиболее быстрых методов оценки мутагенных эффектов у эукариот является анализ частоты доминантных летальных мутаций в половых клетках дрозофилы, чувствительность которого мало отличается от соответствующего теста на лабораторных грызунах (Худолей В.В., 1986). Опыты на Drosophila melanogaster показали (табл.3), что во всех группах, кроме католита, полученного 20 мин экспозицией, количество отложенных яиц на 30-80% превышало уровень контроля. Это напоминает биостимулирующий эффект, ранее обнаруженный в экспериментах на дафниях (Савостикова О.Н., 2008). В то же время, при экспозиции мух к католиту с ОВП = - 16,6 МВ количество отложенных яиц было меньше, чем в контроле. Важно, что в этой серии было обнаружено значимое по сравнению с контролем повышение частоты ПЭЛ, а также доли ПЭЛ в спектре гибели эмбрионов. В этих экспериментах связи ОВП НАВ с частотами ПЭЛ обнаружено не было. В то же время, регрессионный анализ выявил связь между значениями ОВП вод, к которым были экспонированы самцы мух, и частотами образования РЭЛ в их половых клетках (R2=0,70), причем самые высокие частоты РЭЛ были отмечены в контроле. Поэтому снижение частоты
Таблица 3. Влияние неконтактно электрохимически активированных вод на фертильность самцов дрозофилы и частоты доминантных летальных мутаций в половых клетках мух
НАВ, условия активации ОВП, МВ Количество отложенных яиц, Фертильность, % от контроля Частоты доминантных летальных мутаций, % Доля в общей частоте гибели эмбрионов, %
РЭЛ ПЭЛ РЭЛ ПЭЛ
Контроль 322,0 776 100 8,38 ± 0,10 0,52±0,10 0,94 0,06
РЭЛ можно трактовать как гибель спермиев, несущих РЭЛ. Поскольку частота РЭЛ связана как с токсическим, так и с генотоксическим действием изучаемого фактора, обнаруженный эффект можно считать качественно близким наблюдавшемуся на культуре клеток человека (рис.1), что позволяет предположить единство механизмов индукции и элиминации генетических повреждений, индуцированных НАВ в обеих моделях.
На следующем этапе работы в подостром эксперименте на мышах in vivo изучали влияние НАВ на частоту аберраций хромосом в клетках костного мозга. Животных в течение 30 дней выпаивали ad libitum НАВ, приготовленными на московской водопроводной воде.
Анализ полученных данных показал, что уже через 24 часа после начала выпаивания в костном мозге мышей, потреблявших католиты, в разной степени повышалась частота клеток с гепами (ахроматическими пробелами), образование которых связано с возникновением однонитевых разрывов ядерной ДНК (Gileva E.A., 2002.). Следует отметить, что гепы не относят к аберрациям хромосом и всегда учитывают отдельно. На 8 сутки в клетках костного мозга (рис.5А) было обнаружено повышение частоты фрагментов хромосом - индикатора двунитевых разрывов ядерной ДНК (Жимулев И.Ф., 2003; Клаг У., Каммингс М., 2007). Особенно ярко это было видно у мышей, потреблявших католит, полученный самой продолжительной активацией. На 15 и 30 сутки во всех сериях, кроме той, в которой мыши потребляли католит, активированный в течение 5 минут, наблюдалось снижение частоты клеток с аберрациями хромосом по сравнению с контролем, что может говорить о гибели поврежденных клеток.
В большинстве экспериментальных групп в разные сроки наблюдалось повышение митотической активности клеток (рис.5 Б), что следует рассматривать как еще один вариант проявления генотоксической активности (Andersen M.E. et al, 2010; Czakai K et al, 2011).
Объем воды, выпитой мышами, коррелировал с частотой клеток с аберрациями хромосом (r=0,78; р=0,013), что подтверждает индукцию этих генетических повреждений в результате потребления воды. В контрольной группе мышей объем выпитой воды в динамике эксперимента варьировал незначительно, в то время как в группах, потреблявших НАВ, он в начале эксперимента превышал уровень контроля, но затем быстро снижался. Близкие результаты были получены позднее в хроническом эксперименте на крысах (Беляева Н.Н. и др, 2015).
Рисунок 5. Изменение частоты аберрантных клеток (А) и митотической активности (Б) в костном мозге мышей, потреблявших католиты и анолит, полученные бесконтактной электрохимической активацией московской водопроводной воды (кратность по отношению к контролю).
Со значениями ОВП НАВ прямо коррелировали частоты гепов в клетках костного мозга мышей (r = 0,76; р=0,021), а для митотического индекса эта корреляция была обратной (r = - 0,66; р=0,035).
Приведенные данные позволяют сделать заключение о том, что именно свойства НАВ определяли обнаруженные генотоксические эффекты в клетках костного мозга животных.
Как и в опыте на культуре клеток (рис.3) в эксперименте на мышах обнаружен различный характер связи между основными цитогенетическими показателями у анолитов и католитов (рис.6). Так, для анолита повышение частоты аберрантных клеток сочеталось с уменьшением митотической активности (R2 = - 0,71), ситуация, стандартная для генотоксических воздействий (Harrison, Haber , 2006; Ferreira de Oliveira et al, 2014; Valerio-Santiago et al, 2013). Для 20- и 40-мин католитов, наоборот, частота аберрантных клеток повышалась с увеличением митотической активности (R2 = 0,35 и 0,46, соответственно) - что характерно для канцерогенов (Stopper et al, 2003).
Рисунок 6. Соотношение частот хромосомных аберраций и митотической активности в костном мозге мышей при выпаивании различными видами НАВ. Линейные тренды.
Параллельно с постановкой эксперимента на мышах, воды, неконтактно активированные в первые сутки опыта, использовали для приготовления реконструированных сред, в которых культивировали клетки крови человека. Результаты этого эксперимента показали, что инкубация клеток в среде на основе католита, активированного в течение 5 мин, приводила к увеличению пролиферативного пула, повышению частоты 3-ядерных клеток и частоты ускоренно делящихся клеток с повреждениями. В культурах на 20-мин католите также была отмечена повышенная частота 3-ядерных клеток. Важно, что похожие эффекты наблюдались в параллельных культурах, экспонированных разными дозами стандартного мутагена МННГ. При этом эффекты католитов и анолита существенно различались, однако дозовых зависимостей от ОВП в проявлении эффектов католитов выявлено не было. То есть, результаты, полученные на культуре клеток крови человека, качественно воспроизводили результаты эксперимента на мышах. Поэтому можно заключить, что микроядерный тест на культуре крови может служить адекватным экспресс-методом для качественного прогноза генотоксической активности НАВ.
Таким образом, все изученные НАВ проявили генотоксическую активность на одном или нескольких тест-объектах.
Хотя полиэтиленовые пакеты, использованные в наших экспериментах для получения НАВ, разрешены для хранения и замораживания грудного молока, была проведена оценка возможного влияния процесса активации воды на диффузию химических веществ из материала пленки в воду. По абсолютному большинству показателей все образцы неконтактно активированной воды не отличались от исходной, в которой содержание всех обнаруженных соединений не превышало долей ПДК для питьевых вод. Исключение составили неидентифицированные фталаты, содержание которых в католите, активированном при максимальной экспозиции, и в анолите, было значительно выше контроля.
До сих пор было принято считать, что основным параметром воды, определяющим ее биологическую активность, является ОВП (Стехин А.А., Яковлева Г.В., 2007; Широносов В.Г. и др, 2008). Анализ собственных данных, полученных на культуре клеток крови человека и мышах in vivo во всем диапазоне ОВП, не обнаружил связи показателей пролиферации и частоты генетических повреждений клеток с ОВП (рис.7). Результаты этого анализа также показали, что вне зависимости от минерализации вод, использованных для приготовления НАВ, частота клеток с повреждениями зависела от уровня митотической и/или пролиферативной активности в опытах in vivo и in vitro (как это хорошо видно на примере осмотической воды, рис.7).
При раздельном рассмотрении эффектов католитов анолитов и оказалось, что для анолитов практически все биологические показатели коррелировали ОВП и РН НАВ, а для католитов - со светосуммой люминол-геминовой хемилюминесценции воды (СХЛ), причем это относилось как к показателям пролиферативной активности, так и к показателям повреждения ДНК. Эти данные не только еще раз подтверждают качественные различия в генотоксической активности католитов и анолитов, описанные выше (рис.3 и 7), но и вводят в круг физико-химических параметров, ответственных за генотоксические эффекты вод, полученных неконтактной электрохимической активацией, показатели активности свободнорадикальных реакций. Поскольку осмотическая и московская водопроводная воды, на которых проводили описанные выше эксперименты, исходно имели достаточно высокие уровни
Рисунок 7. Связь между показателями пролиферации и повреждения клеток в культуре крови человека (реконструированные среды на основе осмотической воды)
хемилюминесценции, что свидетельствует о значительной исходной активности свободнорадикальных реакций, следующий опыт был поставлен на бутилированной воде
«Пилигрим» с СХЛ = 0,14 усл.ед. Мы предположили, что НАВ, приготовленные на этой воде могут обладать меньшей генотоксической активностью, чем ранее изученные воды. Воду «Пилигрим» неконтактно активировали в тех же условиях, что осмотическую и московскую водопроводную воды, и аналогичным образом использовали для приготовления реконструированных сред для культивирования клеток крови человека. Основные результаты этого эксперимента показаны на рис.8.
Рисунок 8. Частоты митоза и апоптоза (левая ось ординат) и частота делящихся клеток с повреждениями (правая ось ординат) в клетках крови человека, культивированных в реконструированных средах на основе активированной бутилированной воды «Пилигрим».
Как видно, в среде на 5 мин католите (ОВП = 275,3 МВ) митотическая активность клеток в культуре была значительно ниже контроля, а степень асимметрии расхождения хромосом во втором митозе в 6,8 раз превышала контрольный уровень (р=0,021). Католиты, полученные при 20-минутной активации, также как и анолит, стимулировали клетки к делению активнее, чем в контроле (что качественно воспроизводит картину, обнаруженную в клетках костного мозга мышей, рис.6). Увеличение пролиферативной активности сопровождалось повышением частоты поврежденных клеток. Например, в среде на 20 мин католите (ОВП = 168,9 МВ) наблюдалось более чем 4-кратное повышение уровня контроля по частоте двуядерных клеток с множественными МЯ (р=0,041). Частота 2-ядерных клеток с НПМ в 3 раза превышала уровень контроля (р=0,038). В среде на 40-мин католите наблюдалось 5-кратное по сравнению контролем повышение частоты апоптоза (р=0,014), что говорит об увеличении числа клеток с нерепарируемыми генетическими повреждениями. В культурах на анолите (ОВП = 224,4 МВ) было отмечено значительное снижение объема пролиферативного пула, а частоты 2-ядерных клеток с НПМ в 5 раз превышали уровень контроля (р=0,018). Важно, что эффекты католитов, полученных при активации воды «Пилигрим», так же как и для остальных изученных НАВ, качественно отличались от эффектов анолита.
Таким образом, культивирование клеток крови человека в НАВ на основе воды с очень малой активностью свободнорадикальных реакций, вопреки ожиданию, привело к повышению уровней нестабильности генома, причем эти эффекты были выражены более ярко, чем в культурах на НАВ, полученных активацией вод с высокой активностью свободнорадикальных реакций.
Проведенные исследования показали, что все использованные тесты: тест на индукцию ХА в клетках костного мозга мышей, тест на индукцию МЯ в клетках крови человека, культивированных в условиях цитокинетического блока, и тест на индукцию доминантных летальных мутаций в половых клетках дрозофилы оказались пригодными для выявления и оценки генотоксических эффектов НАВ. Полученные данные позволили создать на основе этих тестов минимальный набор для оценки потенциальной генотоксичности активированных вод, которую также можно использовать и для гигиенической оценки безопасности оборудования для их получения. Алгоритм применения этих тестов показан на рис. 9.
Рисунок 9. Алгоритм анализа генотоксических эффектов НАВ
Поскольку оценка генотоксических эффектов является частью токсикологических исследований, решение о возможности применения активированных вод и технологий их подготовки принимают с учетом результатов всех остальных исследований.
ОБСУЖДЕНИЕ
Как показали результаты экспериментов, все изученные НАВ обладали генотоксическим действием, которое проявлялось на одном или нескольких тест-объектах. Самый обширный материал был получен на культуре клеток крови человека, что позволило провести более подробный анализ корреляционных связей между физико-химическими свойствами НАВ и эффектами нестабильности генома в реконструированных средах, приготовленных на их основе.
На рис.10 видно влияние степени минерализации исходной воды на спектр клеточных популяций лимфоцитов в культурах на основе НАВ. Только для католитов (критерий Спирмена) были выявлены значимые корреляции степени минерализации с частотой апоптоза (r = 0,74) и с частотой делящихся клеток с повреждениями (r = - 0,92). Согласованность этих показателей в механизме образования эффектов нестабильности генома исключает случайность обнаруженных связей. Следует отметить, что для анолитов подобные связи выявлены не были, что может быть обусловлено небольшим количеством различных анолитов, изученных в данной работе in vitro.
Корреляционный анализ, проведенный в единой матрице для всех вод, изученных in vitro на клетках крови человека, не выявил значимых взаимосвязей между физико-химическими параметрами НАВ и нестабильностью генома. Однако проведенный раздельно для анолитов (табл.4) и католитов (табл.5) показал, что эффекты нестабильности генома в анолитах были ассоциированы с ОВП и с РН воды, а в католитах - с СХЛ. Обнаружение этих связей показывает, что эффекты нестабильности генома индуцируются в анолитах в результате переноса электронов, а в католитах - путем активации свободнорадикальных реакций. Так, для анолитов была выявлена значимая корреляционная связь ОВП и РН с митотической активностью в культуре, с частотами ускоренно делящихся клеток с генетическими повреждениями и апоптоза - то есть, и с показателями пролиферации клеток, и с показателями повреждения ДНК. Для католитов связи с ОВП и РН выявлено не было, но уровни СХЛ были ассоциативно связаны только с показателями пролиферативной активности. Следует понимать, что торможение пролиферации клеток обычно связано с индукцией генетических повреждений и необходимостью их репарации (Xingxu Huang et al, 2005; Niida, Nakanishi, 2006; Giunta, Jackson, 2011; Orth et al, 2012), а стимуляция - с закреплением имеющихся генетических повреждений в поколениях делящихся клеток и увеличением риска образования опухоли (Smits et al, 2007; Nikitin et al, 2014; Ogrunc et al, 2014).
Помимо уже рассмотренных физико-химических показателей (ОВП, РН, СХЛ) на индукцию эффектов нестабильности генома могла оказывать влияние доля связанной фазы НАВ и, более того, все изученные физико-химические показатели могли быть связаны между собой. Поэтому мы провели корреляционный анализ, в котором исследовали связь значений ОВП, РН и СХЛ с долей СФ НАВ. Неожиданно для нас (табл.6), значения ОВП были ассоциированы только с минимальной (0,0-0,1%) долей связанной фазы воды (r=0,67), уровень СХЛ - с несколько большей, чем для ОВП, ее представленностью в воде (0,1-0,3%; r = - 0,78 и 0,87). Анализ показал, что эффекты в средах на католитах и анолитах, не только качественно различались между собой, но и изменяли знак корреляции между изучаемыми параметрами при изменении доли СФ. Например, в средах на католитах, в которых доля СФ была невелика (0,1-0,2%), ее содержание было ассоциировано со снижением частоты апоптоза, а увеличение доли связанной фазы - с повышением частоты апоптоза. О справедливости выявленных закономерностей говорит согласованность обнаруженных эффектов между собой. Так, для анолитов с минимальной долей СФ было характерно не только снижение митотической активности, но и повышение частоты 1-ядерных (неделящихся) клеток в спектре клеточных популяций. Поэтому в таких средах отмечено еще и снижение частоты ускоренно делящихся клеток с генетическими повреждениями (похожие связи показаны на рис.7). То же наблюдалось по доле асимметричных 3-ядерных клеток среди всех клеток, прошедших в культуре 2
Рисунок 10. Динамика спектра клеточных популяций лимфоцитов крови человека, культивированных в реконструированных средах на основе НАВ, в зависимости от степени минерализации исходной (неактивированной) воды.По оси абсцисс - минерализация (мг/л), по оси ординат - доля каждой фракции клеток в спектре клеточных ПОПУЛЯЦИЙТАБЛИЦА 4. Корреляции между показателями микроядерного теста на культуре клеток крови человека в реконструированных средах на анолитах, приготовленных на основе трех вод: осмотической, московской водопроводной и бутилированной воды «Пилигрим» (критерий Спирмена )
Показатель физико-химических свойств Митоз (%) Апоптоз (%) Спектр клеточных популяций (%) Проли-фератив-ный пул % ускоренно делящихся клеток с повреждениями Степень асимметрии во 2-м митозе Индекс репликации Индекс пролиферации
1 ядерных клеток 3-ядерных клеток 3-ядерных клеток с повреждениями 4-ядерных клеток с повреждениями полия- дерных клеток полия-дерных клеток с повреж- деями делящихся клеток светосумма хемилюминисценции 0,48 - 0,66 - 0,62 0,68 0,59 0,51 0,61 0,22 0,59 0,59 0,37 0,37 0,67 0,63 p=0,53 p=0,34 p=0,38 p=0,32 p=0,41 p=0,50 p=0,39 p=0,78 p=0,40 p=0,41 p=0,62 p=,62 p=0,33 p=0,36
Таблица 5. Корреляции между показателями микроядерного теста на культуре клеток крови человека в реконструированных средах на католитах, приготовленных на основе 3 трех вод: осмотической, московской водопроводной и бутилированной воды «Пилигрим» (критерий Спирмена)
Показатель физико-химических свойств Спектр клеточных популяций (%) Проли-фератив-ный пул % ускоренно делящихся клеток Степень асимметрии во 2-м митозе Индекс репликации Индекс пролиферации
1 ядерных клеток 2-ядерных клеток 4-ядерных клеток 4-ядерных клеток с повреждениями полия- дерных клеток делящихся клеток делящихся клеток с НПМ светосумма хемилюминисценции - 0,71 0,58 0,77 0,69 0,70 0,73 0,59 0,72 0,72 - 0,27 0,75 0,75 p=0,01 p=0,047 p=0,00 p=0,01 p=,01 p=0,01 p=0,04 p=0,01 p=0,01 p=0,41 p=0,01 p=0,01
Таблица 6. Связь интегральных показателей нестабильности генома в клетках крови человека с долей связанной (структурированной) фазы в водах, использованных для приготовления реконструированных сред
(католиты, анолиты и контроль анализировали отдельно, критерий Пирсона)
Диапазон варьирования доли связанной фазы НАВ, ( %) Частота митоза Частота апоптоза % 1-ядерных клеток в спектре клеточных популяций % 1-ядерных клеток % делящихся клеток с МЯ % делящихся клеток с генетическими повреждениями % делящихся клеток в спектре клеточных популяций Пролиферативный пул % ускоренно делящихся клеток с генетическими повреждениями Симметрия расхождения генетического материала в клетках 2-го митоза
0,0 - 0,1 - - -
0,101-0,2 -
0,201-0,3
0,301-0,4
0,401-0,5
0,501-0,6
0,901-1,0 - -
Примечание: показаны только корреляции при р ? 0,05
- обратная корреляция
прямая корреляция
Анолит Католит Контроль
митотических цикла: их частота снижалась с уменьшением пролиферативного пула культуры. Для католитов с максимальным содержанием СФ снижение частоты 1-ядерных клеток в спектре клеточных популяций согласовалось со снижением суммарной частоты делящихся клеток (т.е. снижением объема пролиферативного пула).
Полученные данные позволяют предположить, что изменение доли СФ воды может рассматриваться как еще один новый фактор, ответственный за индукцию нестабильности генома под действием активированных питьевых вод. Естественно, для детального понимания механизмов влияния активированной воды на генотоксические эффекты в живой клетке необходимо проводить специальные исследования, не входящие в задачи данной работы. В то же время, современные представления о транспорте воды в клетку включают два основных механизма: диффузное проникновение отдельных молекул воды через мембрану клетки за счет разницы в осмотическом давлении и транспорт через селективные каналы, «организованные» семейством белков аквапоринов, энергия активации которых в 2-3 раза меньше, чем для диффузного транспорта воды (Agre, Kozono, 2003; Saito et al, 2013; Thommie Karlsson et al, 2013; Шапигузов А.Ю., 2004). То есть, транспорт воды через канал, по крайней мере, в 2 раза более энергетически выгоден, чем диффузный осмос. У человека аквапорины (сейчас известно 10 видов) были найдены в разных тканях, включая почки, мозг, эритроциты крови и др; диаметр пор составляет 3A, что лишь немного больше диаметра молекулы воды. Каждый такой канал в клетках эукариот пропускает через себя до 300 молекул воды в секунду, что говорит о высокой значимости этого механизма для жизнедеятельности клетки. Аквапорины пропускают в клетку только нейтральные молекулы воды, отсеивая даже ионы гидроксония, причем при прохождении по каналам имеющиеся в воде водородные связи разрываются, и в клетки попадают только отдельные молекулы воды. Поэтому можно предположить, что увеличение доли связанной фазы воды в процессе активации может негативно отражаться на стабильности генома и жизнеспособности клеток.
Таким образом, все собственные экспериментальные данные, полученные в настоящем исследовании, позволяют предположить, что при неконтактной (электрохимической) активации воды может реализовываться не один, а несколько механизмов индукции нестабильности генома: А) под действием свободных радикалов, образующихся в католитах, которые повреждают мембраны клеток по механизму индукции перекисного окисления липидов;
Б) под действием электронов, делокализованных на СФ НАВ, при взаимодействии которых с клеточной мембраной может происходить локальное окисление и дальнейшее разрушение фрагментов;
В) в результате образования генотоксичных соединений в воде в процессе ее неконтактной активации в полиэтиленовой или полипропиленовой таре (при выходе небольшого количества мономера и/или пластификатора в воду, в которой присутствуют электроны, ионы, радикалы и ион-радикалы, образовавшиеся в процессе неконтактной активации).
Таким образом, полученные данные показали, что состав исходной (неактивированной) воды, также как и режим активации играют существенную роль в приобретении водой генотоксической активности.