Дослідження методів отримання трансгенних рослин яблуні шляхом генетичної трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens. Схема введення, мікророзмноження, вкорінення in vitro для промислових сортів яблуні Флоріна і двох клонових підщеп яблуні.
Аннотация к работе
Значний інтерес складає проблема стійкості яблуні до гербіцидів тотальної дії та створення сортів, які б мали високу ефективність вкорінення і стриману силу росту. Стійкість до цього гербіциду забезпечує ген pat, внаслідок експресії котрого у трансгенній рослині фосфінотріцин швидко розкладається фісфінотріцинацетилтрансферазою, втрачаючи свою токсичну дію, і не накопичується в обробленій рослині. Серед цих генів особливе місце займає ген ROLB, який підвищує чутливість до ауксину (Delbarre et al., 1994), або ж змінює шляхи проникнення ауксинів (Maurel et al., 1994), що призводить до зростання ефективності вкорінення рослин. Трансгенні лінії (з геном ROLB) вегетативно розмножуваних підщеп яблуні мають у 2,3-2,5 рази вищу ефективність вкорінення в порівнянні з нетрансгенним контролем (Welander and Zhu, 2000; Sedira et al., 2001; Pawlicki-Jullian et al., 2002). На травянистих рослинах також показано, що експресія гену ROLB викликає зміни генеративних органів отриманих клонів - гетеростилію, збільшені розміри маточки та квітколожа (Schmulling et al., 1988).Внаслідок оптимізації методу трансформації з використанням Agrobacterium tumefaciens отримано 11 трансгенних ліній яблуні сорту Флоріна - з них 9 містять різну кількість функціонального гену ROLB, який підвищує здатність до вкорінення та маркерні гени NPTII та gus; одна - функціональний ген pat, який забезпечує стійкість до фосфінотріцину та маркерний ген NPTII, одна - маркерний ген NPTII. Отримані лінії, які містять гени ROLB та pat, можуть бути використані в подальшому в фундаментальних, прикладних дослідженнях та практичному садівництві. З використанням меристеми активно ростучих етиольованих пагонів яблуні розроблено схему введення в кульутуру in vitro та відпрацьовано схеми мікророзмноження для 5 промислових сортів яблуні, регенерантного клону сорту Флоріна і двох клонових підщеп яблуні. На основі розроблених методичних прийомів здійснено трансформацію яблуні сорту Флоріна і отримано трансгенну лінію, що містить ген pat, який забезпечує стійкість отриманої лінії до селективних концентрацій фосфінотріцину в середовищі для мікророзмноження.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Вывод
В результаті проведених досліджень розроблені методи введення культуру in vitro, мікроклонального розмноження, регенерації рослин з листкових експлантів різних сортів яблуні. Внаслідок оптимізації методу трансформації з використанням Agrobacterium tumefaciens отримано 11 трансгенних ліній яблуні сорту Флоріна - з них 9 містять різну кількість функціонального гену ROLB, який підвищує здатність до вкорінення та маркерні гени NPTII та gus; одна - функціональний ген pat, який забезпечує стійкість до фосфінотріцину та маркерний ген NPTII, одна - маркерний ген NPTII. Отримані лінії, які містять гени ROLB та pat, можуть бути використані в подальшому в фундаментальних, прикладних дослідженнях та практичному садівництві.
1. З використанням меристеми активно ростучих етиольованих пагонів яблуні розроблено схему введення в кульутуру in vitro та відпрацьовано схеми мікророзмноження для 5 промислових сортів яблуні, регенерантного клону сорту Флоріна і двох клонових підщеп яблуні.
2. Для забезпечення ефективної регенерації адвентивних пагонів яблуні оптимізовано склад поживних середовищ та умови культивування in vitro 4 сортів яблуні та 1 вегетативно розмножуваної підщепи, що дозволило досягти рівня регенерації пагонів від 85% до 100%.
3. Встановлено, що ефективність генетичної трансформації яблуні значною мірою залежить від штаму Agrobacterium tumefaciens. При використанні суспензії агробактеріального штаму С58С1 для кокультивації з листковими експлантами 3-3,5 тижневого віку на твердому середовищі протягом 2 діб досягнуто ефективності трансформації 7,9%.
4. На основі розроблених методичних прийомів здійснено трансформацію яблуні сорту Флоріна і отримано трансгенну лінію, що містить ген pat, який забезпечує стійкість отриманої лінії до селективних концентрацій фосфінотріцину в середовищі для мікророзмноження.
5. Вперше отримано трансгенні лінії яблуні сорту Флоріна з геном ROLB в геномі, які характеризуються підвищеною здатністю до вкорінення в порівнянні з нетрансгенним контролем та з вегетативно розмножуваною підщепою ММ106.
6. Генетичну модифікацію отриманих клонів встановлено за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з використанням пар праймерів, комплементарних до нуклеотидних послідовностей маркерних генів gus та NPTII і гену ROLB. Гібридизація за Саузерном також підтвердила наявність в ДНК отриманих трансгенних ліній яблуні нуклеотидні послідовності, характерні для генів NPTII та ROLB.
7. Порівняльний аналіз трансгенних клонів яблуні сорту Флоріна (ген ROLB) на канаміцин-вмісному середовищі (100 мг/л) дозволив встановити кореляцію між рівнем ризогенезу та кількістю копій NPTII гену в рослинному геномі.
8. Результати досліджень по вирощуванню отриманих трансгенних клонів в умовах in vivo показали високу здатність цих рослин утворювати додаткове коріння при підгортанні нижньої частини пагону грунтом. Додаткове коріння сприятиме покращенню фізіологічних показників мінерального живлення та підвищенню якірності рослин.
Список литературы
Бартиш И.В., Корховой В.И., Меркулов С.М., Копань В.П. Оптимизация методов культивирования in vitro различных сортов и клоновых подвоев яблони (Malus domestica Borkh) // Физиология и биохимия культурных растений. - 1994. - Т.26, №6. - С. 587-594. (Здобувачем проведено дослідження по оптимізації введення, мікророзмноження, вкорінення та адаптації до умов in vivo 6 сортів та 2 клонових підщеп яблуні, зроблено узагальненнярезультатів та сформульовані висновки).
Бартиш И.В., Корховой В.И. Состав культуральной среды и эффективность образования побегов in vitro из листовых побегов яблони // Физиология растений. - 1997. - Т.44, №3. - С. 440-444. (Здобувач разом зі співавтором розробив схему постановки досліду та безпосередньо виконував експерементальну частину роботи. Встановив особисто склад поживних середовищ, оптимальні співвідношення та концентрації фітогормонів для використовуваних сортів, також здійснював збір, аналіз та узагальнення отриманих результатів їх інтерпретацію).
Бартиш И.В., Светлова Н.Б., Корховой В.И. Зависимость эффективности адвентивного органогенеза из листовых эксплантов яблони от концентрации экзогенных регуляторов роста и солевого состава среды // Физиология и биохимия культурных растений. - 1997. - Т.29, №5. - С. 351-355. (Здобувач безпосередньо виконував роботу з органогенезу, проліферації, вкорінення та адаптації отриманих регенерантних клонів, прийняв участь в аналізі результатів та їх інтерпретації).
Корховой В.И., Радчук В.В., Долгов С.В., Бартиш В.И. Генетическая трансформация клона RF1 яблони сорта Флорина с помощью Agrobacterium tumefaciens // Доповіді Національної академії наук України. - 2000. - № 2. - С. 186-190. (Здобувачем здійснено досліди по трансформації, отриманню трансгенної лінії яблуні сорту Флоріна з геном неоміцинфосфотрансферази (NPTII) та проведено її молекулярно-біологічний аналіз).
Korkhovy V.I., Radchuk V.V. Agrobacterium-mediated transformation of the apple cv. “Florina” with the ROLB gene // Horticulture and Vegetable Growing. - 2001. - Vol. 20 (3). - P. 174-180. (Здобувач отримав трансгенні лінії яблуні сорту Флоріна, які містять гени gus, NPTII та ROLB. Автором здійснено основний обєм робіт по трансформації та селекції трансгенних ліній, здійснено збір та аналіз отриманих результатів, їх узагальнення та сформульовано висновки).
Radchuk V.V, Korkhovoy V.I. The ROLB gene promotes rooting in vitro and increases fresh root weight in vivo of transformed apple scion cultivar‘Florina’// Plant Cell Tiss. Organ Cult. - 2005. - Vol. 81, №2, P. 203-212. (Здобувач розмножив отримані трансгенні лінії для наступного аналізу за допомогою гібридизації за Саузерном. Досліджено здатність утворення коріння як в умовах in vitro, так і в тепличних умовах. Автор здійснював постановку дослідів, збір та інтерпретацію отриманих результатів, їх узагальнення, та написання статті).
Копань В.П., Копань К.М., Болдижева Л.Д., Бартіш І.В., Меркулов С.М., Коломієць М.В., Корховий В.І., Середюк Б.Ю. Прискорення селекційного процесу плодових та ягідних культур // Тези доп. і вист. наук.-практ. конф. присвяч. 25-річчю від дня утвор. Краснокут. досл. ст. с-ва 13-15 липня 1993.- Краснокутськ (Харківськ. обл.). - 1993.- С. 24-25.
Корховой В.И., Бартиш И.В., Копань В.П. Методы микроклонального размножения некоторых сортов и клоновых подвоев яблони (Malus domestica Borkh) // Промислова біотехнологія клонального мікророзмноження плодових і винограду в культурі in vitro: Тези доповіді наук.-практ. конф., серпень 1994. - Херсон. - 1994. - С. 19-21.
Копань В.П., Копань К.Н., Болдыжева Л.Д., Бартиш И.В., Меркулов С.М., Середюк Б.Е., Корховой В.И., Радчук В.В. Основные требования к сортименту для горного садоводства и пути их решения // Интенсификация садоводства на склонах: Тез. докл. научн. конф. (в рамках СНГ) 29 ноября - 2 декабря 1994 г.- Нальчик. - 1994.- С.54-55.
Копань В.П., Копань К.М., Болдижева Л.Д., Бартіш І.В., Меркулов С.М., Середюк Б.Ю., Корховий В.І., Радчук В.В. Віддалена гібридизація, поліплоїдизація та генетична інженерія у створенні принципово нових сортів плодових і ягідних культур // Сучасні проблеми і перспективи розвитку садівництва: Тез н.-в. конф. присвяч. 25-річчю Поділ. досл. ст. ІС.- Вінниця. - 1994.- С. 21-22.
Свєтлова Н.В., Корховий В.І., Бартіш І.В. Вплив різних концентрацій БАП на регенерацію пагонів яблуні сортів Незалежність і Фальстаф. // Наслідки наукових пошуків молодих вчених-аграрників в умовах реформування АПК: Матер. міжн. наук.-практ. конф. - Чабани. - 1996. -Ч. І. - С.35.
Свєтлова Н.В., Корховий В.І. Вплив різних концентрацій БАП і сольового складу поживного середовища на регенерацію яблуні сорту Незалежність // Сад. - 1996. - №1. - С.23.
Корховой В.И., Бартиш И.В., Левенко Б.А. Генетическая трансформация клона RFI яблони сорта Флорина с помощью Agrobacterium tumefaciens // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тезисы докл . VII Международной конф. 25-28 ноября 1997 г. - Москва. - 1997. - С.270-271.
Bartish I.V., Merkulov S.M., Korkhovoy V.I. Genetic transformation of apple and pear cultivars mediated by Agrobacterium tumefaciens, strain A281 // Plant Biotechnology and Genetic Engineering: International Symposium 3-6 October 1994. - Kiev. - 1994.- P. 41.
Bartish I.V., Korkhovoy V.I., Svetlova N.B. Developing of the methods of high-frequency adventitious organogenesis in vitro from leaf explants of some apple (Malus domestica Borkh.) cultivars // Tasks and perspectives of orchard plant breeding. (Collection of Scientific Articles). Lithuanian Institute of Horticulture. - Babtai. - 1995. - P. 107-115.
Korkhovoy V.I., Radchuk V.V., Bartish I.V., Levenko B.A. Genetic transformation of aplle cv. “Florina”// Plant Tissue and Cell Culture: Abstracts of IX International Congress 14-19 June 1999. - Jerusalem. - 1998. - P. 170.
Корховой В.И., Радчук В.В., Бартиш И.В., Долгов С.В. Генетическая трансформация клона яблони сорта Флорина с помощью Agrobacterium tumefaciens // Садоводство и виноградарство 21 века. Итоги и перспективы селекционных исследований: Матер. междунар. науч.-практич. конф. 7-9 сентября 1999 г. - Краснодар. - 1999. - Ч. 3.- С. 138-141.
Korkhovoy V.I., Radchuk V.V., Levenko B.A. Efficient Agrobacterium-mediated transformation and recovery of transgenic plants in apple // Fruit Breeding and Genetics: Abstracts of International Symposium 6-10 September 1999. - Dresden. - 1999. - Р. 42.
Korkhovoy V.I., Radchuk V.V. Interactions of the NPTII and ROLB genes in the transgenic apple plants //Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources: Abstracts of International Symposium 26-31 May 2002. - Yalta. - 2002. - P. 72-73.
Копань В.П., К.Н. Копань, А.Н.Ярещенко, Ю.Б.Козулина, С.И.Гребенюк, В.И.Корховой. Олигогенная селекция - путь целенаправленного решения селекционных програм в плодоводстве // Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве: Материалы международной научно-методической конференции 28-31 июля 2003 г. - Орел. - 2003. - С.167-169.
Korkhovy V.I., Radchuk V.V. The ROLB gene influence on rooting ability of transgenic lines of apple cultivar “Florina” // Application of biotechnology in breeding cultivars suitable for sustainable fruit production: Abstracts of International Workshop 12-14 May 2005. - Skierniewice. - 2005. - P. 45.