Визначення спектру цитокінів, що продукуються культивованими некомітованими та комітованими за остеогенним шляхом лініями мезенхімальних стовбурових клітин. Рекомендації щодо експериментального використання клітинної остеоімунної моделі in vitro.
Аннотация к работе
Але існують порушення остеорепаративного процесу, що спричинені явищем «остеогенної недостатності», яке обумовлене руйнуванням камбію кісткової тканини, та, як наслідок, клітини не можуть реалізувати свої гістобластичні потенції, спрямовані на відновлення кістки, що призводить до її тривалого незростання чи субституції волокнистою сполучної тканиною [Гололобов В.Г. та ін., 2004]. Постає питання відносно функціонального статусу клітин-попередників, в тому числі мезенхімальних стовбурових, або стромальних, клітин (МСК) кісткового мозку, остеобластів та остеокластів при патологічних станах, зокрема, в кістковій рані, та яким чином гуморальні та клітинні фактори впливають на остеоімунні процеси, які задіяні в порушеннях остеорепарації та регенерації кісткової тканини. Не дивлячись на те, що при репаративному остеогенезі є передумови для повного відновлення втраченої кісткової тканини, кількість ускладнень, повязаних з порушенням або сповільненням загоєння кісткової рани після травматичного пошкодження, залишається достатньо високою, і, за даними різних авторів, коливається від 2,5 - 18% [Claes L., Willie B., 2007; Романенко К.К., 2002; Горидова Л.Д., Романенко К.К., 2000] до 25% [Афаунов А.И., Афаунов А.А., 1999; Гайдуков В.М., 1995]. Обєкт дослідження - комплекс мембранних антигенів міжклітинної адгезії - CD44, CD62L; активації та костимуляції - CD54, CD56, CD58, CD166; інтегринових ланцюгів - CD29, CD49a, CD49b, CD49c; HLA-молекул - HLA-A, B, C, HLA-DR; а також спектр цитокінів - ФНП-?, ІЛ-1?, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-8 та маркер остеогенних ліній - лужна фосфатаза, котрі секретуються in vitro некомітованими та комутованими за остеогенним шляхом мезенхімальними стовбуровими клітинами 1-4 пасажів, що ізолюються зі строми кісткового мозку людини. Вперше визначено розбіжності в експресії поверхневих антигенів досліджуваними мезенхімальними стовбуровими клітинами (МСК) in vitro: фенотип комітованих за остеогенним шляхом МСК відрізняється від фенотипу некомітованих експресією HLA-DR на рівні поодиноких клітин та припиненням експресії CD56; вперше визначено особливості та розбіжності в секреції спектру цитокінів некомітованими та остеоіндукованими МСК in vitro: культивовані некомітовані та комітовані МСК продукують ІЛ-1? та ІЛ-2, а комітовані за остеогенним шляхом МСК виявляють гіперпродукцію ІЛ-6 та ІЛ-8 до 276,5 пг/мл і 106,6 нг/мл відповідно; вперше досліджено взаємозвязок змін фенотипу і функціональної активності некомітованих та остеоіндукованих МСК; вперше розроблено клітинну остеоімунну модель, яка дала змогу науково обґрунтувати імунні властивості МСК в культурі за рахунок поверхневої експресії функціональних молекул і секреції остеоактивних цитокінів досліджуваними клітинами, та розглядати культивовані МСК як ефективні активатори кісткової резорбції, запалення і остеоімунних реакцій в процесі порушеної остеорепарації, особливо в тих випадках, коли останній має тенденцію до хронізації та «завмирає» в проліферативній фазі запалення.Детекцію ЛФ в комітованих за остеогенним шляхом МСК проводили в 24-лункових планшетах за схемою: визначення ферменту на четверту (n=42), сьому (n=42), десяту (n=42), тринадцяту (n=42), шістнадцяту (n=42) і девятнадцяту (n=42) добу. Результати виражалися кількістю ЛФ-позитивних культур на кожну лінію протягом всього періоду остеогенної індукції МСК, починаючи з четвертої доби. Маркування поверхневих антигенів некомітованих та остеоіндукованих МСК здійснювали в культурах 1-4 пасажів від 14-ти ліній за модифікованою здобувачем та співавторами методикою прямого та непрямого імунофлуоресцентного фарбування для флуоресцентної мікроскопії, захищеною патентом України на корисну модель [Пат. Кондиційоване середовище, або супернатант, збирали виключно з моношарових конфлуентних культур МСК на першу, третю та пяту добу в групі культивованих некомітованих МСК, та на десяту, тринадцяту, шістнадцяту та девятнадцяту добу в групі комітованих за остеогенним шляхом МСК. В процесі остеогенної індукції кістковомозкових ліній МСК секреція ЛФ клітинами починається між 7-ю та 10-ю добою, максимально збільшується до 13-ї доби та її рівень стабільно детектується в культурах комітованих за остеогенним шляхом МСК на 13, 16 і 19-ту добу остеоіндукції.В дисертаційній роботі здійснено теоретичне узагальнення та наведено нове вирішення наукового завдання відносно визначення імунних властивостей та ефективності спрямованої індукції мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку людини за остеогенним шляхом, що призводить до змін рецепторного апарату та динаміки цитокінової продукції досліджуваними клітинами з можливістю стимуляції остеорепаративного процесу за рахунок остеоімунних гуморальних та клітинних взаємодій. Комітовані за остеогенним шляхом імунорегуляторні культури мезенхімальних стовбурових клітин людини з 10-ї доби індукції починають продукувати лужну фосфатазу - 78% культур (p<0,05). Впродовж тритижневого процесу остеогенної індукції мезенхімальні стовбурові клітини змінюють морфологію з фіброблас