Дослідження геномної динаміки одержаних калюсних видів за допомогою аналізу випадково ампліфицируемої поліморфної ДНК. Цитогенетична оцінка калюсних, суспензійних культур. Методи визначення рівня мінливості геному унгернії Віктора у природних умовах.
Аннотация к работе
Вирішення цих завдань покладають на культуру in vitro, яка забезпечує прискорене розмноження та нарощування біомаси, що не поступається за своїми властивостями тканинам інтактних рослин. Перепоною для використання цього підходу може стати сомаклональна мінливість, яка, зокрема, може бути однією з причин порушення синтезу вторинних метаболітів у культурі in vitro, що спостерігається в унгернії Віктора. Показано, що рівень та особливості геномних змін в культурі in vitro знаходяться під впливом низки чинників - складу живильного середовища, умов вирощування, ступеня відхилення культури від організованого росту, тривалості культивування тощо. Незважаючи на обмеженість чисельності виду та його значення для фармакології, не було проведено жодних популяційно-генетичних досліджень унгернії Віктора у природі. Такі дослідження дозволять оцінити загрозу генетичної ерозії цього рідкісного виду та створити наукову основу для розробки ефективної стратегії збереження його генофонду і раціональної експлуатації природних заростей - ресурсів лікарської сировини.Досліджено особливості сомаклональної мінливості культури тканин унгернії Віктора (U. victoris) на цитогенетичному та молекулярно-генетичному рівнях за різних умов і тривалості культивування, проведено порівняння особливостей та рівня змін в культурі in vitro та відмінностей між рослинами із природної популяції. Тривале вирощування культури тканин U. victoris призводить до кількісних і якісних змін поодиноких RAPD-фрагментів (до 3,8 % із числа проаналізованих), а також до міксоплоїдії, значного ступеня поліплоїдизації клітин (до 36n, при модальному класі 2n-4n), дивергенції генетичних структур клітинних популяцій калюсних ліній, отриманих із однієї цибулини. Характер молекулярних змін культури тканин відтворював відмінності між індивідуальними представниками природної популяції рослин - більшість RAPD-ампліконів, поліморфних у культурі in vitro, були варіабельними і у рослин із природної популяції. Виявлено RAPD-фрагменти, поліморфні у всіх досліджених клітинних ліній, що, вірогідно, представляють ділянки геному унгернії Віктора з підвищеною схильністю до змін у культурі in vitro.
Вывод
калюсний суспензійний поліморфний унгернія
Досліджено особливості сомаклональної мінливості культури тканин унгернії Віктора (U. victoris) на цитогенетичному та молекулярно-генетичному рівнях за різних умов і тривалості культивування, проведено порівняння особливостей та рівня змін в культурі in vitro та відмінностей між рослинами із природної популяції.
1. Тривале вирощування культури тканин U. victoris призводить до кількісних і якісних змін поодиноких RAPD-фрагментів (до 3,8 % із числа проаналізованих), а також до міксоплоїдії, значного ступеня поліплоїдизації клітин (до 36n, при модальному класі 2n-4n), дивергенції генетичних структур клітинних популяцій калюсних ліній, отриманих із однієї цибулини.
2. Характер молекулярних змін культури тканин відтворював відмінності між індивідуальними представниками природної популяції рослин - більшість RAPD-ампліконів, поліморфних у культурі in vitro, були варіабельними і у рослин із природної популяції. Виявлено RAPD-фрагменти, поліморфні у всіх досліджених клітинних ліній, що, вірогідно, представляють ділянки геному унгернії Віктора з підвищеною схильністю до змін у культурі in vitro.
3. Виявлено вплив фітогормонального складу живильного середовища на рівень молекулярно-генетичних змін культури тканин, але не на специфічність сомаклональних змін U. victoris - не відмічено виникнення однакових змін, як цитогенетичних, так і молекулярно-генетичних, у різних ліній, які вирощували на одному середовищі. Встановлено збільшення частки метафаз із диплоїдним набором хромосом за зміни поверхневого на глибинне вирощування.
4. Виявлено пряму залежність рівня сомаклональної мінливості від тривалості культивування in vitro - виникнення змін RAPD-спектрів калюсних культур протягом першого року вирощування і подальше накопичення цих змін протягом другого та третього років.
5. За результатами RAPD-аналізу генетичні зміни у неморфогенних калюсів були у декілька разів (до 2,5 разів) вищими, ніж у морфогенних, що вказує на існування оберненої залежності між рівнем сомаклональної мінливості й рівнем диференціації культури тканин.
6. Мінливість у культурі in vitro за результатами RAPD-аналізу була майже на два порядки нижчою порівняно із відмінностями між рослинами із природної популяції (генетичні відстані за Неем склали 0,38-2,99 % для культури тканин та 26,9-47,0 % для рослин), що свідчить про можливість використання підібраних для культивування in vitro умов з метою збереження генофонду цього рідкісного виду.
Рекомендації.
· З метою зниження рівня генетичної мінливості культури тканин U. victoris для збереження генофонду рідкісного ендемічного виду та його прискореного розмноження перевагу слід віддавати короткотривалому (до одного року) культивуванню морфогенного типу калюсу, використовуючи як ауксин б-НОК.
· Пролонговане культивування, використання як ауксину 2,4-Д та неморфогенний тип калюсу рекомендовані для отримання підвищеного рівня сомаклональних змін з метою отримання матеріалу для клітинної селекції.
· Для надійної детекції сомаклональних змін рекомендується одночасне застосування цитогенетичного та молекулярно-генетичного методів, оскільки зміни рівня плоїдності культури тканин не завжди супроводжуються появою RAPD-поліморфізму і навпаки.
Список литературы
1. Бублик О.М. Вивчення геномної мінливості культури тканин Ungernia victoris за допомогою RAPD-маркерів / О.М. Бублик, І.О. Андрєєв, К.В. Спірідонова, Л.П. Можилевська, В.А. Кунах // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2006. - Т. 4, № 1. - С. 3 -11.
2. Бублик Е.Н. Цитогенетическая изменчивость клеточных линий Ungernia victoris при выращивании на питательных средах различного состава / Е.Н. Бублик, В.И. Адонин, В.А. Кунах // Цитология и генетика. - 2008. - Т. 42, № 1. - С. 29-36.
3. Бублик О.М. Мінливість морфогенної та неморфогенної культури тканин Ungernia victoris за результатами RAPD-аналізу / О.М. Бублик, І.О. Андрєєв, К.В. Спірідонова, В.А. Кунах // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2008. - Т. 6, № 1. - С. 44-51.
4. Бублик О.М. Генетична гетерогенність рідкісного ендемічного виду Ungernia victoris (Amaryllidaceae): RAPD-аналіз / О.М. Бублик, І.О. Андрєєв, К.В. Спірідонова, В.І. Музика, І.В. Колоніна, В.А. Кунах // Український ботанічний журнал. - 2008. - Т. 65, № 3. - С. 445-452.