Встановлення особливостей функціонування 5-ліпоксигенази з застосуванням 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів карбонових кислот та алостеричних ефекторів у ліпоксигеназному каталізі. Дослідження впливу гідрофобних нітроксильних сполук.
Аннотация к работе
Ліпоксигенази (лінолеат:кисень оксидоредуктази, КФ 1.13.11.12.) - група ферментів, які каталізують введення кисню до 1,4-цис,цис-пентадієнового фрагменту поліненасичених жирних кислот з утворенням відповідних гідропероксидів. З дією цих ферментів повязують окиснення ліпопротеїнів малої щільності [Heydeck D. et al., 2001; Schewe T., 2002] та ліпідів мембранного матриксу на перших етапах апоптозу [Maccarrone M. et al., 2001; Feussner I. et al., 1998] і при гіперчутливій відповіді рослинних клітин на дію стресу [Croft K. et al., 1990; Jalloul Окиснення за участю ліпоксигеназ мембран мітохондрій, ендоплазматичного ретикулума та хлоропластів викликає утворення пор, яке ініціює руйнування органел; збільшує концентрацію Са2 у цитоплазмі; впливає на активність мембранозвязаних ферментів, порушуючи узгодженість у ланцюгах дихання та фотофосфорилювання, що формує у клітині стан окисного стресу [Van Leyen K. et al., 1998; Grullich C. et al., 2001; Vijayvergiya C. et al., 2004]. Дисертаційна робота є складовою частиною науково-дослідних робіт Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (тема: "Вивчення механізмів дії та регуляції ферментів каскаду поліненасичених жирних кислот у системах, що моделюють біологічні мембрани", державний реєстраційний номер 0103U005437; тема: "Молекулярна асоціація, функціональні властивості та шляхи регуляції активності ферментів каскадів поліненасичених жирних кислот", державний реєстраційний номер 0106U004305). естер арбоновий нітроксильний каталіз Для досягнення мети вирішувались наступні завдання: Визначити придатність 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних карбонових кислот для дослідження вільнорадикальних процесів під час 5-ліпоксигеназного каталізу, зокрема, вивчити їх взаємодію з неіонними міцелами та мембранними структурами природного походження; дослідити вплив гідрофобних нітроксильних сполук на перебіг 5-ліпоксигеназного каталізу та зясувати механізм їх дії.У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у встановленні особливостей функціонування 5-ліпоксигенази та значенні алостеричних ефекторів в ліпоксигеназному каталізі. В результаті роботи обґрунтовано використання ліофільних нітроксильних сполук у вивченні вільнорадикальних процесів, що супроводжують 5-ліпоксигеназний каталіз та визначено особливості механізму дії ферменту і участь алостеричних ефекторів у функціонуванні 5-ЛО. На підставі кінетичних досліджень запропоновано механізм дії 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот, який полягає в перехопленні нітроксильними сполуками інтермедіатів радикальної природи, що утворюються під час каталітичного циклу, та не передбачає безпосередньої взаємодії нітроксильних сполук з ферментом.
План
Основний зміст роботи
Вывод
У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у встановленні особливостей функціонування 5-ліпоксигенази та значенні алостеричних ефекторів в ліпоксигеназному каталізі. В результаті роботи обґрунтовано використання ліофільних нітроксильних сполук у вивченні вільнорадикальних процесів, що супроводжують 5-ліпоксигеназний каталіз та визначено особливості механізму дії ферменту і участь алостеричних ефекторів у функціонуванні 5-ЛО.
1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилові естери гідрофобних кислот знижують швидкість окиснення лінолевої кислоти або лінолевого спирту, що каталізуються 5-ЛО. На підставі кінетичних досліджень запропоновано механізм дії 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот, який полягає в перехопленні нітроксильними сполуками інтермедіатів радикальної природи, що утворюються під час каталітичного циклу, та не передбачає безпосередньої взаємодії нітроксильних сполук з ферментом.
Ступінь інгібування ферментативного окислення 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидиниловими естерами гідрофобних кислот не залежить від хімічної будови ліпофільного замісника і визначається хімічною природою субстрату реакції та присутністю алостеричного ефектора.
Взаємодія 5-ЛО з алостеричним ефектором - додецилсульфатом натрію приводить до збільшення кількості короткоіснуючих вільних радикалів під час каталітичного циклу. Висунуто припущення, що алостеричний ефектор викликає передчасну дисоціацію фермент-субстратного комплексу та виток радикальних інтермедіатів з активного центру ферменту, що дозволяє використовувати систему 5-ліпоксигеназного каталізу у присутності додецилсульфату натрію за умов міцелярної системи як модель перекисного окиснення ліпідів для скрінінгу потенційних інгібіторів.
Фосфатидилінозит та фосфатидилхолін при ферментативному окисненні лінолевої кислоти за умов міцелярної системи заміщують молекули субстрата, звязані з ферментом, що передбачає алостеричний механізм регуляції активності 5-ліпоксигенази цими фосфоліпідами.
Список литературы
1. Харченко О. В., Кулініченко (Харитоненко) Г. І., Бутович І. А. Кінетичні механізми окислення лінолевої кислоти 5-ліпоксигеназою із Solanum tuberosum L. // Укр. біохім. журн. - 1999. - Т. 17, № 4. - С. 40-44.
2. Вовк А. И., Харченко О. В., Харитоненко А. И., Кухарь В. П., Бабий Л. В., Казачков М. Г., Мельник А. К., Хильчевский А. Н. Гидрофобные нитроксильные радикалы - ингибиторы окисления линолевого спирта 5-липоксигеназой // Биоорг. химия. - 2004. - Т. 30, № 4. - С. 436-440.
3. Харченко О. В., Вовк А. И., Харитоненко А. И., Кухарь В. П., Бабий Л. В., Казачков М. Г., Мельник А. К., Хильчевский А. Н. Ингибирующие свойства стабильных нитроксильных радикалов в реакциях окисления линолевой кислоты и линолевого спирта, катализируемых 5-липоксигеназой // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т. 77, № 1. - С. 82-87.
4. Вовк А. И., Мищенко И. Н., Харченко О. В., Бугас Р. В., Харитоненко А. И., Бабий Л. В., Самусь Н. В., Канивец Н. П., Мельник А. К. Влияние липофильных тиазолиевых солей на фотофосфорилирование в хлоропластах гороха. // Физиол. и биохим. культ. раст. - 2005. - Т. 37, № 2. - С. 106-116.
5. Харитоненко Г. І., Харченко О. В. Фосфатидилхолін та фосфатидилінозит - алостеричні регулятори 5-ліпоксигенази з бульб картоплі // Біополімери і клітина. - 2008. - Т. 24, № 3. - С. 254-259.
6. Харитоненко Г.І., Скатерна Т.Д., Мельник А.К., Бабий Л.В., Харченко О.В. Дослідження взаємодії 5-ліпоксигенази з алостеричним ефектором - додецилсульфатом натрію // Укр. біохім. журн. - 2008. - Т. 80, № 3. - С. 31-39.
7. Babenko V., Butovich I., Kazachkov M., Kulinichenko (Kharitonenko) A., Paliy T. Phospholipids as possible 5-lipoxygenase regulator on membrane level. // Abstr. of 24th Meeting FEBS, Barcelona, Spain. -1996. - P. 210.
8. Вовк А.І., Міщенко І.В., Харченко О.В., Бугас Р.В., Бабій Л.В., Харитоненко Г.І. Вплив ліпофільних тіазолієвих катіонів на фотофосфорилювання в хлоропластах гороху // XX Українська конференція з органічної хімії. Тези доповідей. - Одеса, 2004. - С. 395.
9. Харитоненко A. И., Харченко О. В. Роль фосфатидилинозита и фосфатидилхолина в липоксигеназном катализе // Межд. конф. „Современная физиология растений: от молекул до екосистем”. Материалы докладов. - Сыктывкар, 2007. - С. 152-153.
10. Харченко О. В., Казачков М. Г., Скатерная Т. Д., Харитоненко A. И., Копич В. Н. Кинетические особенности ферментативного окисления линолевого спирта в присутствии 5-липоксигенази клубней картофеля (Solanum tuberosum L.) // Межд. конф. „Современная физиология растений: от молекул до екосистем”. Материалы докладов. - Сыктывкар, 2007. - С. 153-154.
11. Kharitonenko G.I., Kharchenko O. V. Phoshatidylcholine and phosphatidilinositol are allosteric regulators of 5-lipoxygenase from potato tuber // Abstr. of 2nd International Symposium Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture, Kyiv, Ukraine. - 2007. - P. 85.