Нормативні значення глюкоцереброзидазної та хітотриозидазної активності для населення України. Скринінг мажорних мутацій у гені глюкоцереброзидази серед пацієнтів з хворобою Гоше (ХГ). Алгоритм лабораторного обстеження хворих з підозрою на наявність ХГ.
Аннотация к работе
Основним підтверджуючим методом діагностики ХГ вважається біохімічне виявлення зниженої глюкоцереброзидазної активності в тканинах організму - первинного біохімічного дефекту, що лежить в основі патологічного процесу і обумовлений мутаціями в гені глюкоцереброзидази (GBA) (Cox T.M., 2001). Разом з тим мутації у різних ділянках гену виникають з різною частотою та суттєво відрізняються за тяжкістю фенотипового прояву: або взагалі переривають роботу ферменту, або лише змінюють його структуру, що призводить до наявності високої залишкової активності (Hodanova K. et all). Останнім часом обговорюється можливість використання в якості допоміжного біохімічного маркеру для діагностики ХГ хітотриозидазної активності плазми крові, збільшення якої є наслідком патологічного процесу накопичення нерозщеплених метаболітів у макрофагах (Бейер Е.М. с соавт., 2000). Метою роботи було вивчення біохімічної та молекулярно-генетичної характеристики у осіб з підозрою на наявність хвороби Гоше серед родин високого ризику на Україні для розробки стратегії ранньої діагностики цієї патології. Обовязкове визначення хітотриозидазної активності в плазмі крові, що є основою патенту України “Спосіб діагностики хвороби Гоше”, було включено до реєстру галузевих нововведень МОЗ України (№ 77/20/04, № реєстру 20-21 від 2004р.) та впроваджено у практику установ системи охорони здоровя МОЗ України.Матеріалом для дослідження були зразки периферичної крові осіб трьох груп: Група пошуку - 100 осіб. Цю групу склали дорослі та діти віком від 4 місяців до 51 року (61 особа жіночої статі та 39 осіб чоловічої статі) Це пацієнти з усіх регіонів України, які були направлені в період з 2000 по 2006 роки до медико-генетичного центру Української дитячої спеціалізованої лікарні “ОХМАТДИТ” з попереднім діагнозом хвороби Гоше. До підгрупи А були віднесені особи з глюкоцереброзидазною активністю нижчою ніж 5,1 нмоль/год/мг білка (26 осіб), а до підгрупи Б - особи з глюкоцереброзидазною активністю вищою ніж 5,1 нмоль/год/мг білка (74 особи). У двох пацієнтів (З.А. та П.С.) в аспіратах кісткового мозку були знайдені Гоше-подібні клітини, а у пацієнта В.В. такі клітини в аспіратах кісткового мозку були відсутні і візуалізувались лише у біоптаті селезінки після спленектомії. З іншого боку, при визначенні глюкоцереброзидазної активності у групі контролю було виявлено 10 осіб, у яких глюкоцереброзидазна активність була нижчою, ніж 5,1 нмоль/год/мг білка.В даній роботі вперше проведено ґрунтовні дослідження з приводу особливостей біохімічної діагностики ХГ, досліджено спектр мажорних мутацій у пацієнтів з ХГ серед населення України та запропоновано алгоритм лабораторного обстеження при підозрі на наявність ХГ. Встановлено рівні нормативних значень ферментативних активностей для української популяції: глюкоцереброзидазна - 7,2 ± 2,1 нмоль/год/мг білка; хітотриозидазна - 29 ± 21 нмоль/год/мл плазми. Глюкоцереброзидазна активність серед пацієнтів з ХГ в Україні склала 2,8 ± 1,3 нмоль/год/мг білка, у батьків хворих - 5,7 ± 2,2 нмоль/год/мг білка; хітотриозидазна активність у пацієнтів з ХГ склала 16574 ± 7450 нмоль/год/мл плазми. Доведено, що за результатами біохімічного дослідження глюкоцереброзидазної активності в гомогенаті лейкоцитів не можливо виявити гетерозиготний стан носія мутації у гені GBA та встановити остаточний діагноз ХГ. Показано, що пацієнти з генотипом N370S/N370S (4 особи) мали легку форму захворювання; пацієнти з генотипом N370S/ L444P (7 осіб) мали як легку (5 осіб), так і середньої тяжкості (2 особи) форму ХГ; у пацієнтів з мутацією N370S в одному алелі та рідкісною мутацією чи комплексом мутацій в іншому, перебіг захворювання був обумовлений впливом саме рідкісних мутацій, що добре узгоджується з описаними генотип-фенотиповими кореляціями при ХГ.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Вывод
В даній роботі вперше проведено ґрунтовні дослідження з приводу особливостей біохімічної діагностики ХГ, досліджено спектр мажорних мутацій у пацієнтів з ХГ серед населення України та запропоновано алгоритм лабораторного обстеження при підозрі на наявність ХГ.
1. Встановлено рівні нормативних значень ферментативних активностей для української популяції: глюкоцереброзидазна - 7,2 ± 2,1 нмоль/год/мг білка; хітотриозидазна - 29 ± 21 нмоль/год/мл плазми.
2. Глюкоцереброзидазна активність серед пацієнтів з ХГ в Україні склала 2,8 ± 1,3 нмоль/год/мг білка, у батьків хворих - 5,7 ± 2,2 нмоль/год/мг білка; хітотриозидазна активність у пацієнтів з ХГ склала 16574 ± 7450 нмоль/год/мл плазми.
3. Доведено, що за результатами біохімічного дослідження глюкоцереброзидазної активності в гомогенаті лейкоцитів не можливо виявити гетерозиготний стан носія мутації у гені GBA та встановити остаточний діагноз ХГ.
4. За результатами проведеного кореляційного аналізу показано, що тяжкість перебігу ХГ, не залежить від залишкової глюкоцереброзидазної активності в гомогенаті лейкоцитів.
5. Частота мутації N370S в гені GBA серед обстежених пацієнтів України з ХГ склала 42,3 %, що добре узгоджується з середньою частотою, притаманною для різних країн Європи. Частота мутації L444P склала 15,4 %, що дещо нижче ніж середня в європейських країнах (24,2%).
6. Відсутність мутації 84GG серед обстежених нами пацієнтів з ХГ добре узгоджується з літературними даними щодо панетнічного розповсюдження цієї мутації.
7. Показано, що пацієнти з генотипом N370S/N370S (4 особи) мали легку форму захворювання; пацієнти з генотипом N370S/ L444P (7 осіб) мали як легку (5 осіб), так і середньої тяжкості (2 особи) форму ХГ; у пацієнтів з мутацією N370S в одному алелі та рідкісною мутацією чи комплексом мутацій в іншому, перебіг захворювання був обумовлений впливом саме рідкісних мутацій, що добре узгоджується з описаними генотип-фенотиповими кореляціями при ХГ. Серед пацієнтів України з ІІІ, нейронопатичним типом ХГ не було знайдено жодного алелю з характерною для цієї форми хвороби мутацією L444P.
8. Молекулярно-генетичні дослідження дозволяють підтвердити діагноз та, незважаючи на певний клінічний поліморфізм, прогнозувати важкість плину захворювання. Доведено, що лише комплексне обстеження з використанням клінічних, параклінічних, морфологічних та біохімічних методів, може забезпечити остаточне встановлення діагнозу ХГ.
9. Розроблений алгоритм лабораторного обстеження пацієнтів з підозрою на наявність ХГ забезпечує стратегію раціонального обстеження групи високого ризику для уникнення встановлення хибнопозитивного чи хибнонегативного діагнозу.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Недобой А.М., Ольхович Н.В., Горовенко Н.Г. Особливості біохімічної діагностики хвороби Гоше на сучасному етапі //Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім.П.Л.Шупика.- 2004.- Вип. 13.- Кн. 5.- С.300-307.
Особистий внесок: проведення біохімічних досліджень, статистична обробка результатів, аналітична інтерпретація, написання статті
2. Н.Г.Горовенко, В.Д.Дроздова, А.М.Недобой, Н.В.Ольхович, Н.О.Пічкур, М.А.Циганкова, О.В.Радзіховська Можливість підвищення точності біохімічної діагностики хвороби Гоше //Цитологія і генетика.- 2006.-Т.40, №3.-С. 67-71.
Особистий внесок: проведення біохімічних досліджень, статистична обробка результатів, робота з літературою, написання статті
3. Н.Г.Горовенко, А.М.Недобой, Н.В.Ольхович, Т.П.Іванова, О.М.Кочнєва, Н.О.Пічкур, І.С.Грегуль Визначення хітотриозидазної активності в плазмі крові як критерій підтверджуючої діагностики хвороби Гоше //Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів.-2006.-Т.4, №1.-С.68-75
Особистий внесок: проведення біохімічних досліджень, аналіз отриманих результатів, написання статті, формулювання висновків
4. А.М.Недобой, Н.В.Ольхович, Н.О.Пічкур, Н.Г.Горовенко Особливості молекулярної діагностики хвороби Гоше //Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів.-2006.-Т.4, №2.-С.156-163
Особистий внесок: проведення молекулярно-генетичних досліджень, аналіз отриманих результатів, написання статті
5. Горовенко Н.Г., Ольхович Н.В., Недобой А.М. МКВ:А61В5/00, А61В6/03 Спосіб діагностики хвороби Гоше// патент № 63743А, заявл.09.06.2003, опубл.15.01.04р. бюл.№1
Особистий внесок: проведення біохімічних досліджень, аналіз отриманих результатів, робота з літературними джерелами, оформлення патенту на винахід
6. Ольхович Н.В., Галаган В.О., Дроздова В.Д., Радзиховська О.В., Пічкур Н.О., Циганкова М.А., Недобой А.М. Клініко-біохімічна характеристика пацієнтів з хворобою Гоше з України // Матеріали III Зїзду медичних генетиків України.-Львів.- 2002.-С.68
Особистий внесок: проведення біохімічних досліджень, аналіз отриманих результатів, написання тез
Особистий внесок: проведення біохімічних досліджень, робота з літературою, написання тез
9. Горовенко Н.Г., Дроздова В.Д., Недобой А.Н., Ольхович Н.В., Иванова Т.П., Кочнєва О.П., Пичкур Н.А., Грегуль И.С. Опыт заместительной ферментотерапии в лечении болезни Гоше в Украине // Молекулярная и прикладная генетика. Научные труды. (Материалы 2 го съезда молекулярных биологов) - Минск, 2005. - Т.1. - С.266.
Особистий внесок: проведення специфічних біохімічних досліджень, аналіз отриманих результатів, написання тез
10. Галаган В.О., Ольхович Н.В., Недобой А.М., Циганкова М.А., Пічкур Н.О., Радзіховська О.В., Щербак Ю.О., Грегуль І.С., Нагнібєда І.М. Роль біохімічних досліджень в діагностиці лізосомних хвороб накопичення //Матеріали ІІ Українського конгресу з клінічної генетики з міжнародною участю “Метаболічні спадкові захворювання”.- Харків. 2005.
Особистий внесок: проведення біохімічних досліджень, аналіз отриманих результатів, написання тез
11. Natalia Gorovenko, Vera Drozdova, Alla Nedoboy, Natalia Olkhovich, Tatiana Ivanova, Oksana Kochneva, Natalia Pichkur Clinical and laboratory characterization of Ukrainian Gaucher patients. European Study Group on Lysosomal Diseases (15 th ESGLD Workshop). Norway.- Oslo.- 2005. -P.108.
Особистий внесок: проведення біохімічних та молекулярно-генетичних досліджень, аналіз отриманих результатів, написання тез
12. Natalia Pichkur, Alla Nedoboy, Natalia Olkhovich, Oksana Kochneva, Tatiana Ivanova, Natalia Gorovenko Effects of ERT on patient with type 3 Gaucher disease. European Study Group on Lysosomal Diseases (15 th ESGLD Workshop). Norway.- Oslo.- 2005. P.156.
Особистий внесок: проведення біохімічних та молекулярно-генетичних досліджень, аналіз отриманих результатів, написання тез
13. N.G.Gorovenko, N.V.Olkhovich, N.A.Pichkur, A.N.Nedoboy, E.V. Radzihovska, M.A.Tcigankova, L.P.Sheyko. Diagnosis of lysosomal diseases in Ukrainian patients. //European Journal of Human Genetics .-2006.- V. 14.- Supplement 1.- P.261.
Особистий внесок: проведення біохімічних та молекулярно-генетичних досліджень, аналіз отриманих результатів, написання тез