Знакомство с вопросами вегетативного размножения хвойных растений методом культуры in vitro. Особенности влияния стерилизующего агента на выживаемость эксплантов и состав питательной среды. Древесные растения как сложные объекты для культуры in vitro.
Аннотация к работе
Проведено вычленение точек роста и меристематических тканей вегетативных частей древесных растений хвойных пород. В качестве эксплантов использовали апикальные почки и части стебля сеянцев, а также верхушечные почки и части годичных побегов средневозрастных хвойных растений. Традиционные способы вегетативного размножения не дают возможности получать многочисленное потомство от одного дерева или его части в течение всего года, не гарантируют отсутствие вирусов в посадочном материале и сохранение свойств растения. Эта проблема решается с помощью принципиально новых методов вегетативного размножения, основанных на культивировании изолированных клеток, тканей и органов растений в стерильных условиях - на искусственных питательных средах в условиях in vitro [3]. Весьма существенное влияние оказывают также видовые и генотипические особенности древесных растений, что требует порой значительной модификации методик и сред для их размножения.Введение в культуру in vitro вегетативных частей ели европейской и ели колючей показало, что данный способ размножения хвойных пород требует особого соблюдения всех этапов стерилизации и условий культивирования. На 4-й день после посадки было отмечено побурение большинства эксплантов и их сильное заражение бактериальной микрофлорой. На 10-е сутки культивирования жизнеспособными оставались 33% апикальных почек сеянцев и 83% верхушечных почек взрослых растений ели колючей. Впоследствии почки сеянцев приобрели желтую окраску и к началу третьей недели после помещения на питательную среду окончательно некротизировались.Результаты исследований показали, что введение в культуру in vitro вегетативных частей взрослых растений хвойных пород - кропотливый и специфический процесс, требующий детального подхода к каждому этапу культивирования.
Введение
В исследованиях рассматривается вопрос вегетативного размножения хвойных растений методом культуры in vitro. Проведено вычленение точек роста и меристематических тканей вегетативных частей древесных растений хвойных пород. В качестве эксплантов использовали апикальные почки и части стебля сеянцев, а также верхушечные почки и части годичных побегов средневозрастных хвойных растений. Отмечено влияние стерилизующего агента на выживаемость эксплантов и состава питательной среды - на скорость образования каллуса.
На сегодняшний день в России и за рубежом довольно хорошо отработано микроклональное размножение древесных пород как для декоративных целей, так и для лесных питомников. Но, несмотря на то, что достигнуты достаточно хорошие результаты по различным направлениям лесной биотехнологии, их широкое внедрение в лесохозяйственную практику не наблюдается [1, 2].
С внедрением новых приемов и методов выращивания посадочного материала появилась возможность расширить ассортимент пород, размножаемых вегетативно, заменить у некоторых пород семенное размножение вегетативным. Традиционные способы вегетативного размножения не дают возможности получать многочисленное потомство от одного дерева или его части в течение всего года, не гарантируют отсутствие вирусов в посадочном материале и сохранение свойств растения. Эта проблема решается с помощью принципиально новых методов вегетативного размножения, основанных на культивировании изолированных клеток, тканей и органов растений в стерильных условиях - на искусственных питательных средах в условиях in vitro [3].
Используя метод микроклонального размножения, можно получить большое количество оздоровленного и выровненного посадочного материала в кротчайшие сроки, что значительно ускорит процесс получения товарной продукции и повысит ее качество [4].
Древесные растения, особенно хвойные, ? сложные объекты для культуры in vitro. Все типы тканей и органов у них сильно заражены грибами и бактериями, что значительно затрудняет обеспечение асептики эксплантов. Весьма существенное влияние оказывают также видовые и генотипические особенности древесных растений, что требует порой значительной модификации методик и сред для их размножения. Для повышения коэффициента размножения необходимо каждому виду растения с учетом его естественного ареала произрастания подбирать индивидуальные условия культивирования. Но, несмотря на эти сложности, методы микроклональной биотехнологии открывают реальные пути уже сейчас получать в массовом количестве элитный посадочный материал с заранее заданными свойствами, а также с высокой эффективностью размножать ценные гибриды [5].
Древесные, особенно хвойные растения, характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений, которые в изолированных тканях окисляются фенолазами. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентивных почек. Способность растения-донора к формированию адвентивных почек с возрастом постепенно исчезает полностью. Несмотря на все трудности, ученые все чаще используют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений [6].
На основании свойства тотипотентности клеток в биотехнологии микроклонального размножения хвойных растений появилось два новых направления - соматический и микроспориальный эмбриогенез. Изучение соматического и микроспориального эмбриогенеза открывает большие перспективы в познании процесса клеточной дифференцировки и реализации морфогенетических программ в эмбриогенезе и раннем онтогенезе растительного организма, а также в получении высокопродуктивных генетически однородных чистых линий [7].
В институте леса им. В.Н.Сукачева СО РАН большинство исследований, посвященных проблеме микроклонального размножения хвойных пород древесных растений in vitro, выполнено методом соматического эмбриогенеза. Использование в качестве эксплантов мегагаметофитов, незрелых зиготических зародышей, семядолей, гипокотиля, микроспороцитов, микроспор и пыльцы у лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb), сосны сибирской (Pinus sibirica Rupr.), сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и кедрового стланика (Pinus pumila Regel.) позволило получить у данных видов растений соматические зародыши и зародышеподобные структуры [1, 7-12].
Недостатком данного метода является наличие контролируемого опыления для получения чистых линий. Строго учитываются сроки взятия образцов: семена собирают в предсемядольной стадии развития зародыша. Данный способ требует специализированного оборудования для контроля над опылением и сбором семян. Проведенные исследования показали, что успешное формирование эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ) зависит от срока сбора семян, стадии введения зародышей в культуру и растения-донора [7].
Уровень наследуемости ценных признаков роста при таком размножении довольно низок [13]. Исходным лесокультурным материалом являются семена, от качества которых в значительной степени зависит успешность выращивания лесных культур. Это объясняется тем, что многие свойства древесного растения (форма кроны и ствола, энергия роста, сопротивляемость заболеваниям и вредителям и др.) определяются наследственностью, отраженной в генетическом коде семян [3].
Вегетативный способ размножения, основанный на культивировании изолированных клеток, тканей и органов растений на искусственных питательных средах в условиях in vitro, позволяет получать посадочный материал независимо от урожая семян и наиболее полно сохранять в потомстве хозяйственно-ценные признаки и свойства материнского растения [3]. В то же время данный способ размножения имеет специфические трудности: ткани хвойных растений содержат большое количество вторичных соединений, ингибирующих деление и рост клеток, а также множество поверхностных микроорганизмов, что снижает способность тканей к регенерации [14].
Цель исследования - выявление наиболее эффективного способа ускоренного размножения хвойных пород для нужд лесного и садово-паркового хозяйства. В работе использован метод микроклонального размножения растений in vitro, основанный на вычленении точки роста сеянцев и меристематических тканей из вегетативных частей средневозрастных древесных растений хвойных пород.
Главная задача для реализации поставленной цели - введение в культуру in vitro видов хвойных растений с последующим микроклональным размножением полученных регенерантов. вегетативный размножение хвойный
1.Материалы и методы
Объектом исследования служили сеянцы, выращенные из семян в климатической камере, и средневозрастные растения ели колючей (Picea pungens Engelm) и ели европейской (Picea abies L. Karst.), произрастающие в естественных условиях.
При введении в культуру in vitro видов хвойных растений использовали стандартную питательную среду Мурасиге-Скугу с добавлением антибиотика, сахарозы, ИУК и активированного угля. В качестве эксплантов использовали апикальные почки и части стебля сеянцев, а также верхушечные почки и части годичных побегов взрослых растений.
Все работы с культурой клеток и тканей in vitro в биотехнологической лаборатории проводили в стерильных (асептических) условиях. Стерилизация растительного материала проведена путем погружения в 5%-ный раствор гипохлорита натрия (NAOCL) сеянцев и побегов на 30 минут. После стерилизации растительные ткани промыли в 3-4 порциях стерильной дистиллированной воды. Затем поверхность почек, сеянцев и части стеблей взрослых растений протирали ватой, смоченной этанолом. После очистки точек роста от почечных чешуй и стеблей от хвои и коры экспланты погрузили в 96? этанол на 30 секунд.
Простерилизованные апикальные почки, освобожденные от почечных чешуй, поместили на питательную среду. Молодые побеги, разрезанные на более мелкие участки длиной около 1 см, также поместили на питательную среду.
Пробирки с эксплантами в течение двух недель культивировали без доступа света при температуре 22-25 ОС и влажности воздуха 70%. Дальнейшее культивирование проводили при 26 °C, световом периоде 16 ч и освещенности 4-5 тыс. люкс лампами ДРЛ-50.
Вывод
Введение в культуру in vitro вегетативных частей ели европейской и ели колючей показало, что данный способ размножения хвойных пород требует особого соблюдения всех этапов стерилизации и условий культивирования. На 4-й день после посадки было отмечено побурение большинства эксплантов и их сильное заражение бактериальной микрофлорой. На 10-е сутки культивирования жизнеспособными оставались 33% апикальных почек сеянцев и 83% верхушечных почек взрослых растений ели колючей. Причиной гибели остальных эксплантов, в основном, являлось заражение. Впоследствии почки сеянцев приобрели желтую окраску и к началу третьей недели после помещения на питательную среду окончательно некротизировались. Начало образования каллуса на почках взрослых растений зафиксировано на 17-й день культивирования. К этому же времени жизнеспособными осталось 33% эксплантов, которые в дальнейшем пересаживали каждые две недели на свежую питательную среду без добавления активированного угля. Отмечено, что уголь адсорбирует действие активных веществ в среде и существенно уменьшает их исходную концентрацию, в результате происходит замедление каллусообразования. При культивировании эксплантов на питательной среде без активированного угля скорость нарастания каллусной массы увеличилась. Перед третьим пассажем было произведено деление эксплантов по продольной оси. В настоящее время эксперимент продолжается.
К современным технологиям повышения устойчивости растений, в том числе полученных технологиями in vitro (в период адаптации к естественным условиям произрастания), можно отнести инокуляцию корневой системы растений микроскопическими симбиотическими грибами. Для этих целей в лаборатории «Экологической безопасности» Удмуртского государственного университета проводятся исследования пределов устойчивости выделенных из естественных условий популяций эндотрофных грибов к действию неблагоприятных факторов и разрабатываются способы использования данных изолятов культур микроскопических грибов для повышения устойчивости растений (через инфицирование ими корневой системы саженцев).Результаты исследований показали, что введение в культуру in vitro вегетативных частей взрослых растений хвойных пород - кропотливый и специфический процесс, требующий детального подхода к каждому этапу культивирования. Введение в культуру in vitro клеток и тканей ели европейской не дало положительных результатов при данных условиях. Проведено введение в культуру in vitro вегетативных частей растений ели колючей, позволяющее при дальнейшем культивировании и размножении получить посадочный материал, наиболее полно сохранивший в потомстве хозяйственно-ценные признаки и свойства материнского растения.
Исследования проводятся при частичном финансировании гранта РФФИ «Мой первый грант» (проект № 16-34-00855).
Список литературы
вегетативный размножение хвойный
1. Ворошилова Е.В., Третьякова И.Н. Соматический эмбриогенез в культуре мегагаметофитов и зиготических зародышей Pinus sibirica // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: материалы Х международ. конф., 14-18 октября 2013 г. - Казань. - 2013. - С. 107.
2. Costanza A., MCCORD S. Forest Biotechnology and Its Responsible Use: A Biotech Tree Primer by the Institute of Forest Biotechnology// Createspace . - 2011. - 30 с.
3. Лесные культуры: учеб. пособие / под общ. ред. проф. А.Р.Родина. - Н. Новгород. - 2009. - 464 с.
4. Коренев И.А., Зонтиков Д.Н. Перспективы развития микроклонального размножения древесных и недревесных растений в Костромской области // Тр. Санкт-Петерб. НИИ лесного хозяйства. - СПБ. - 2011, вып. 1 (24), ч. 2. - С. 52-55.
5. Маркова И.А. Современные проблемы лесовыращивания (Лесокультурное производство): учебное пособие. - СПБ.: СПБГЛТА. - 2008. - 152 с.