Особенности цито-иммунологических показателей мокроты и функциональной активности легочных макрофагов детей с бронхиальной астмой контролируемого и неконтролируемого течения - Автореферат
Цитологический состав и иммунологические показатели индуцированной мокроты, функциональной активности легочных макрофагов у детей с контролируемым и неконтролируемым течением бронхиальной астмы. Причины неточной оценки контролируемости заболевания.
Аннотация к работе
Особенности цито-иммунологических показателей мокроты и функциональной активности легочных макрофагов детей с бронхиальной астмой контролируемого и неконтролируемого течения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наукРабота выполнена на кафедре факультетской педиатрии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия министерства здравоохранения и социального развития России» Защита диссертации состоится «29» февраля 2012 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия министерства здравоохранения и социального развития России» по адресу: 454092, г. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия министерства здравоохранения и социального развития России».Бронхиальная астма (БА) относится к социально-значимым заболеваниям, что определяется ее распространенностью в популяции, высокими показателями обращаемости на уровне первичной медицинской помощи, тяжестью течения, а также возможностью развития смертельных исходов (Barnes P.G., 2006, Геппе Н.А., 2007; Баранов А.А., Хаитов Р.М., 2008; Чучалин А.Г., 2008). Таким образом, существующий в настоящее время метод индуцированной мокроты позволяет производить оценку цито-иммунологических показателей мокроты, а также в перспективе дает возможность оценить функциональную активность отдельных популяций клеток, в частности, легочных макрофагов. Выявить особенности цитологического состава и иммунологических показателей индуцированной мокроты, функциональной активности легочных макрофагов у детей с контролируемым и неконтролируемым течением бронхиальной астмы. Исследовать цитологический состав индуцированной мокроты у детей с контролируемым и неконтролируемым течением легкой персистирующей и среднетяжелой бронхиальной астмы. Оценить иммунологические показатели индуцированной мокроты у детей с контролируемым и неконтролируемым течением легкой персистирующей и среднетяжелой бронхиальной астмы.
Список литературы
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования результатов кандидатских диссертаций и 1 патент РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на ___ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 24 рисунками. В списке литературы указаны 253 источников, из них 107 отечественных и 146 иностранных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Тип исследования: по типу поперечного среза.
Метод выборки: сплошной (по мере поступления в стационар).
Источниковая популяция: дети с БА, поступившие на обследование в детское аллергологическое отделение Муниципального учреждения здравоохранения городскую клиническую больницу №1 (МУЗ ГКБ №1) г. Челябинска в осенне-зимний период 2008-2009 гг.
Критерии включения: возраст от 5 до 16 лет, легкая персистирующая или среднетяжелая БА (в соответствии с критериями «Национальной программы», 2008) контролируемого или неконтролируемого течения; отсутствие в течение предшествовавшего месяца обострений БА, вакцинации; прием базисной терапии не менее 1 месяца до начала исследования; согласие на участие в исследовании.
Группу сравнения составили 16 детей того же возраста, без аллергических заболеваний, находящиеся в детском кардиоревматологическом отделении МУЗ ГКБ №1 на обследовании по поводу синдрома вегетативной дистонии или пролапса митрального клапана 1 степени.
Критерии исключения: наличие в течение предшествовавшего месяца эпизодов острых инфекционно-воспалительных заболеваний, табакокурение.
На всех детей была заполнена персональная анкета, состоящая из нескольких разделов: общие сведения о ребенке, подробный аллергологический анамнез, данные анамнеза жизни, дополнительные методы исследования. Проводилось исследование функции внешнего дыхания (ФВД) на аппарате «Spirolab II» исходно и фармакологическая проба с ?2-агонистом короткого действия (сальбутамол), исследование цитологического состава назального секрета и ИМ (окраска по Романовскому Д.Л., подсчет клеточных элементов не менее чем в 10 полях зрения, не менее 200 клеток, результат отображался в процентах), исследование иммунологических показателей ИМ, морфофункциональных характеристик легочных макрофагов..
Для исследования использовали мокроту, собранную у детей натощак, после ингаляции 5% раствора хлорида натрия; проводилась премедикация ?2-агонистом короткого действия (сальбутамол). В ИМ определяли следующие показатели: количество белка и муцина (Кочетов Г.А. 1980), уровень продукции эндогенного оксида азота (NO), который оценивали по концентрации конечных стабильных метаболитов с помощью реакции Гриса в модификации Э.Н. Коробейниковой (2002). Уровни иммуноглобулинов и интерлейкинов определяли методом ИФА. Для количественного иммуноферментного определения SIGA, IFN-?, общего IGE, IL-1?, IL-4, IL-8, IL-10, MCP-1 использовали тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бэст» (г. Новосибирск). Результат реакции регистрировали при помощи аппарата «Multiscan Plus» и выражали в мкг/мл (SIGA), пг/мл (IL-1?, IL-4, IL-8, IL-10, MCP-1), и МЕ/мл (IGE). Для удобства интерпретации полученных результатов все показатели были пересчитаны на единицу белка.
Производился подсчет количества ЛМ в мокроте с последующей оценкой их адгезивной способности. Оценку адгезивной реакции легочных макрофагов проводили с помощью нединамического метода (Редчиц Е.Г., Гузаева В.О.,1991), а тест распластывания мононуклеаров по методу Rollany H. (1982). Для оценки внутриклеточных метаболических процессов макрофагов использовались цитохимические методы (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996), которые позволили изучить интенсивность реакций на гликоген (ШИК-реакция по Мак Манусу), сукцинатдегидрогеназу (метод Нахласа, Валькера, Зелигмана), альфа-глицерофосфатдегидрогеназу (метод Нарциссова), кислую фосфатазу (метод Goldberg и Barka), пероксидазу. Кислородзависимые метаболические процессы в легочных макрофагах исследовали по интегральному спонтанному и стимулированному НСТ-тесту (Нагаев Б.С., Шубич М.Г., 1981; Park B. et al.,1968). Интенсивность всех цитохимических реакций оценивали цитофотометрически (Козинец Г.И. и др.,1986) с помощью фотометрической насадки ФМЭЛ-1А с умножителем ФЭУ-79 и выражали показателем интегральной оптической плотности (Славинский А.А.,1989).
Лизосомальную активность легочных макрофагов изучали с помощью метода флюоресцирующего зондирования отдельных клеток в тесте с акридиновым оранжевым (Фрейдлин И.С.,1976; Подосинников И.С., Бабаченко И.В., Захаров А.М.,1985) с определением числа клеток с лизосомальной активностью и среднего цитохимического показателя.
Изучение фагоцитарной активности легочных макрофагов проводили на модели поглощения микросфер латекса с определением фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса легочных макрофагов (Фримель Г.,1987).
Статистический анализ данных проводился при помощи пакета статистических программ STATISTICA 6.0 (STATSOFT, 2001) и SSPSS 12.0.
При распределении признака в выборке близком к нормальному, количественные значения представлялись в виде средней арифметической и ее среднеквадратичного отклонения (M±?). При непараметрическом распределении признака рассчитывались медиана и интерквартильный размах (Ме; 25-75%).
Для оценки различий между двумя группами в количественных признаках при распределении, близком к нормальному, применяли t-критерий Стьюдента, в остальных случаях - непараметрический U-тест Манна-Уитни. Для сравнения средних более чем в двух независимых группах применяли критерий Краскелла-Уоллиса. При уровне р<0,05 проводилось попарное сравнение групп с использованием непараметрического теста Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Оценка межгрупповых различий по качественным признакам проводилась с использованием критерия c2 и точного критерия Фишера.
При проведении корреляционного анализа использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Оценка риска развития события проводилась путем вычисления величин относительного риска (ОР) и 95% доверительного интервала (95% ДИ).
Для всех видов анализа статистически достоверными считались значения p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изначально было отобрано 150 детей с БА, 109 из которых наблюдались с контролируемым, а 41 с неконтролируемым течением. При детальном расспросе детей с контролируемым течением было установлено, что из 109 детей 64 (59%) имели частично контролируемое течение заболевания (44% и 74% соответственно при легкой и среднетяжелой БА) и поэтому не были включены в исследование.
Таким образом, согласно критериям включения/исключения, в исследование было включено 86 детей с легкой персистирующей и среднетяжелой БА, а также 16 детей группы сравнения.
Рис. 1. Распределение обследованных детей по группам
В ходе исследования дети с БА были разделены на 4 группы (рис.1).
Средний возраст обследованных детей составил 10,1±2,8 лет. В качестве базисной терапии дети с легкой персистирующей БА получали препараты группы кромонов, со среднетяжелой БА - ингаляционные глюкокортикостероиды (71,4%) и комбинированные препараты (28,6%).
Среди других аллергических заболеваний у детей с БА наиболее часто встречался аллергический ринит, составляя в группах с легкой БА - 77,4-81,5%, в группах со среднетяжелой БА - 85,7-100%. Более чем у 40% детей на момент обследования зафиксирована эозинофилия назального секрета; среднее содержание эозинофилов составило по группам от 12,3% до 60,7%. В группе сравнения детей с эозинофилией назального секрета выявлено не было.
Частота атопического дерматита в группах варьировала от 21,4% до 37,0%. Следует отметить, что в группах со среднетяжелой БА атопический дерматит в 100% случаев сочетался с аллергическим ринитом.
Во всех группах с БА выявлен высокий уровень общего IGE и эозинофилов периферической крови (р<0,05 с группой сравнения). Между группами значимых различий не выявлено.
Среди значимых факторов риска, имеющих существенное значение в развитии БА, была отмечена наследственная отягощенность по аллергическим заболеваниям (аллергические заболевания у одного или обоих родителей) - установлена у 59 из 86 детей (68,6%), что достоверно выше, чем в группе сравнения. Была установлена ее значимость как фактора риска развития среднетяжелой БА - ОР=1,4; 95%ДИ [1,01;1,9]. Анализируя данные раннего анамнеза, были получены достоверные отличия в группах с БА по частоте перинатального поражения центральной нервной системы - более чем в 70% случаев, что в 3 раза чаще, чем в группе сравнения (р<0,05 ).
Частота дисбиоза кишечника в группах детей с БА была в 2,5 раза выше, чем в группе сравнения (р<0,05). Проявления аллергического диатеза в анамнезе имели более 50% детей независимо от тяжести и течения БА (р=0,003 с группой сравнения). Установлена значимость перинатального поражения ЦНС и дисбиоза кишечника как факторов риска развития БА (ОР=3,8; 95%ДИ [1,4; 10,6] и ОР=2,6; 95%ДИ [1,3; 5,4] соответственно).
В группах детей с неконтролируемым течением БА частота раннего искусственного вскармливания была выше, чем в группах с контролируемым течением заболевания (48,8% и 28,8% соответственно против 13% в группе сравнения). По данным нашей работы установлено, что раннее искусственное вскармливание являлось фактором риска развития именно неконтролируемого течения БА (ОР=1,7; 95%ДИ [0,97; 2,9]).
При изучении значимости триггерных факторов в возникновении приступов БА обнаружено, что чаще всего ими являлись пыль (70,4-87,1%), острые респираторные заболевания (71,0-85,7%) и контакт с животными (50,0-64,3%). Отмечено, что в группах с неконтролируемым течением БА роль физической нагрузки в качестве триггера приступов прослеживается более отчетливо в сравнении с контролируемым течением заболевания. Достоверных отличий между группами выявлено не было. При детальном расспросе 150 детей с БА у части из них проведена переоценка степени контроля заболевания (см. рис. 1). Были проанализированы причины, которые могли привести к недооценке клинических симптомов БА.
При расспросе детей и их родителей о частоте дневных симптомов выявлено, что 24 детей из 41 (59%) с неконтролируемым и 14 детей из 64 (22%) с частично контролируемым течением БА (которые не вошли в дальнейшее исследование) не отмечают ухудшения состояния в школе, тогда как половина из них признаются в использовании ?2-агонистов короткого действия.
При дополнительных уточняющих вопросах детям, наблюдающимся с контролируемым течением БА (109 человек) и считающим, что они хорошо переносят физическую нагрузку, было установлено, что у 32 из них (29%) при подъеме по лестнице до 3 этажа (нагрузка выбрана условно для стандартизации полученных результатов) появлялся кашель и «тяжелое» дыхание. У 8 детей (7%) отмечалось появление кашля и «небольшое» нарушение дыхания после перемены между уроками.
У 33 пациентов из 82 (40%) с легкой персистирующей БА симптомы заболевания появлялись на уроке физической культуры, но, как правило, этих детей не освобождали от занятий. Таким образом, переносимость физической нагрузки, которая является триггером бронхоспазма, по-разному трактуется врачом, ребенком и его родителями.
Потребность в препаратах неотложной помощи (в основном ?2-агонистах короткого действия) является не менее важным показателем уровня контроля заболевания. У детей дошкольного возраста почти всегда удается установить истинную частоту использования данных препаратов из беседы с родителями. У детей, которые начали посещать школу, самостоятельное бесконтрольное использование бронхолитиков затрудняет оценку этого показателя и требует уточнений. Так, при детальном расспросе 109 детей, наблюдавшихся с контролируемым течением БА, 29 детей (27%) использовали бронхолитики в школе чаще двух раз в неделю, не ставя в известность родителей.
По нашим данным, проводят спирометрию регулярно (не реже 2 раз в год) 71 из 150 детей с БА (47%).
Гораздо хуже обстоит ситуация с проведением пикфлоуметрии. Согласно нашим данным, лишь 15 детей из 41 (37%) с неконтролируемым течением БА имели дома собственный пикфлоуметр, из которых только 9 (60%) проводили пикфлоуметрию регулярно. Следует отметить, что запись результатов в респираторный дневник делали всего 2 ребенка. Часть детей просто не хотели использовать пикфлоуметр даже при его наличии - 4 из 41 (10%).
В остальных случаях с неконтролируемым течением БА основной причиной отсутствия пикфлоуметра родители называли его высокую стоимость - 17 из 26 (65%); 2 (8%) - впервые узнали о существовании данного прибора во время настоящего исследования; 7 (27%) - не видели смысла в его приобретении.
Из 109 детей, наблюдающихся с контролируемым течением БА, собственный пикфлоуметр имели 63 ребенка (58%). Из них 26 (42%) проводили пикфлоуметрию нерегулярно (не чаще 1-2 раз в неделю). 37 детей (58%) проводили пикфлоуметрию ежедневно, но только 3 заносили результаты в респираторный дневник.
Таким образом, точность оценки дневных и ночных симптомов, переносимости физической нагрузки, кратности использования препаратов неотложной помощи зависит от многих факторов: возраста ребенка; источника получения информации (ребенок, родители); временного промежутка за который проводился анализ вышеуказанных показателей; единообразия трактовки симптомов, приступов БА и их эквивалентов; уровня комплайнса между ребенком, его родителями и врачом.
Далее в соответствии с целями и задачами работы нами были исследованы клеточный состав и иммунологические показатели ИМ у детей с БА и группы сравнения.
Одним из перспективных неинвазивных методов оценки изменений слизистой оболочки бронхов при БА является подсчет клеточных элементов в мокроте; нами исследован не только цитологический состав ИМ, но и проведена оценка ее цитокинового профиля.
Проводя индукцию мокроты по протоколу, предложенному Куличковым В.И. с соавт. (2009), у всех детей было получено достаточное для исследования количество материала.
Выявлены следующие особенности клеточного состава ИМ у обследованных детей (табл. 1): - высокое содержание эозинофилов во всех группах с БА (р<0,05 с группой сравнения).
- низкое содержание макрофагов в группах с БА, особенно при неконтролируемом течении заболевания (2 и 4 группа) - в 1,5-1,7 раз меньше, чем в группе сравнения (р<0,05).
- высокое содержание нейтрофилов в группах со среднетяжелой БА (3 и 4 группа) - в 1,6-1,9 раза выше, чем в группе сравнения (р<0,05). В группах с легкой персистирующей БА содержание нейтрофилов от группы сравнения достоверно не отличалось.
Таблица 1
Клеточный состав индуцированной мокроты обследованных детей, Me; 25-75%
Группы Эозинофилы, % Нейтрофилы, % Макрофаги, % Лимфоциты, %
Примечание. Значимость различий (р<0,05): * - с группой сравнения.
Среди всех детей с БА эозинофилия мокроты (более 3%) выявлена у 26 детей из 86 (30,2%). При легкой персистирующей БА число детей с эозинофилией ИМ оказалось бoльшим при контролируемом течении заболевания (35,5% против 22,2% при неконтролируемом течении), однако среднее содержание эозинофилов в мокроте было выше у детей с неконтролируемым течением астмы. При среднетяжелой БА число детей с эозинофилией ИМ и среднее содержание в ней эозинофилов достоверно не отличались между группами с контролируемым и неконтролируемым течением.
В результате исследования иммунологических показателей ИМ, мы выявили: - более высокие уровни белка в группах с БА относительно группы сравнения, что возможно объясняется повышенной проницаемостью микроциркуляторного русла, связанного с активностью воспалительного процесса; достоверные отличия с группой сравнения получены только в группе легкой персистирующей БА неконтролируемого течения (p?0,05);
- значительное снижение IFN-?, обладающего широким спектром противовирусного действия, во всех группах с БА (р<0,05 с группой сравнения); особенно выражено снижение при среднетяжелой неконтролируемой БА (в 4 раза относительно группы сравнения);
- низкое содержание SIGA в группах с БА, однако, достоверные отличия с группой сравнения получены только в группе легкой персистирующей БА контролируемого течения (p?0,05);
- высокую концентрацию ИЛ-1? в группах детей со среднетяжелой БА (р<0,05 с группой сравнения);
- бoльшие показатели IL-4 в группах с БА, хотя достоверной разницы с группой сравнения выявлено не было; возможно это связано с тем, что все дети с БА длительно получали базисную терапию;
- высокое содержание IL-8 при БА, особенно при неконтролируемом течении (p<0,05 с группой сравнения); известно, что данный цитокин влияет на активацию нейтрофилов, число которых увеличивается по мере возрастания степени тяжести БА;
- более низкие показатели IL-10 при БА относительно группы сравнения, но достоверных отличий выявлено не было;
- высокое содержание NO в группах с легкой персистирующей БА; более низкие показатели NO в группах со среднетяжелой БА скорее всего связаны с более интенсивной противовоспалительной базисной терапией;
- значительное снижение содержания MCP-1 во всех группах с БА относительно группы сравнения (р<0,05), что, возможно, связано с принимаемой базисной терапией, а так же со сниженным количеством легочных макрофагов в группах с астмой; между группами с БА достоверных отличий получено не было;
- высокий уровень IGE во всех группах с БА (р<0,05 с группой сравнения).
Помимо этого, у детей с легкой персистирующей БА проводилась комплексная оценка функционального состояния легочных макрофагов (ЛМ) с использованием цитохимических и иммунологических методов (табл. 2).
При исследовании количества ЛМ установлено, что их абсолютное содержание в мокроте у детей с контролируемым и неконтролируемым течением БА было соответственно в 1,3 и 1,8 раза меньше, чем в группе сравнения, что коррелировало с их относительным содержанием.
Известно, что усиление адгезивных свойств сопутствует возбуждению мононуклеарных фагоцитов, являясь важным признаком активации клетки (Фрейдлин И.С.,1984; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989).
Адгезивные свойства ЛМ изучались нами через 30 и 60 минут после начала инкубации. Коэффициент адгезии от 30 к 60 минуте инкубации возрос: в группе сравнения - на 15,0%; в группе с БА контролируемого течения - на 8,1%; в группе с неконтролируемым течением БА - на 10,9%.
Такая же тенденция прослеживается при исследовании способности к распластыванию. Как видно из табл. 2, у детей группы сравнения число распластанных ЛМ от 30 к 60 минуте увеличилось на 9,9%; у детей с контролируемым течением БА - на 16,5%; в группе с неконтролируемым течением - на 8,1%.
Таблица 2
Абсолютное содержание ЛМ и их мембранные характеристики в группах с легкой персистирующей БА и в группе сравнения, Me; 25-75%
Группы 1 группа БА контролир. (n=10) 2 группа БА неконтролир. (n=10) Группа сравнения (n=10) Р
Инкубация 60 минут 89,2 84,6-95,0 83,4* 80,0-87,0 94,9 91,6-100,0 Р2-гс<0,05
Таким образом, у детей с БА имеет место депрессия распластывания и нарушение адгезивных свойств ЛМ, которые наиболее выражены при неконтролируемом течении заболевания.
Характер цитохимического спектра ЛМ во многом отражает реактивные изменения в организме. В связи с этим была проведена оценка содержания в ЛМ энергетического субстрата (гликогена), а также активность ферментов (альфа-глицерофосфатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы) и оксидазных систем, генерирующих супероксидные радикалы.
В ЛМ детей с контролируемым течением БА (1 группа) содержание гранулярного гликогена оказалось ниже, в то время как у детей с неконтролируемым течением БА (2 группа), напротив, выше относительно группы сравнения (р<0,05). Эти результаты находятся в полном соответствии с данными, полученными при анализе интенсивности цитохимической реакции на ?-глицерофосфатдегидрогеназу (?-ГФДГ), участвующую в гликолитическом пути расщепления углеводов (рис. 2).
Рис. 2. Содержание ШИК-позитивного материала (гликоген) и интенсивность цитохимической реакции на ?-ГФДГ и сукцинатдегидрогеназу в ЛМ исследуемых детей.
Примечание. Значимость различий (p<0,05): * - с группой сравнения, ** - со 2 группой.
Анализ активности сукцинатдегидрогеназы (рис. 2), являющейся одним из важных ферментов энергетического обмена (индикатор цикла трикарбоновых кислот), позволил установить ее снижение у детей с БА, особенно с неконтролируемым течением относительно группы сравнения (p<0,05).
В целом, результаты цитохимического исследования ЛМ детей с легкой персистирующей БА позволяют констатировать, что имеют место нарушения цитохимического спектра этих клеток. В частности, у детей с контролируемым течением БА наблюдается повышение активности сукцинатдегидрогеназы и усиление гликолитического пути расщепления углеводов, о чем свидетельствует повышение активности альфа-глицерофосфатдегидрогеназы и снижение содержания ШИК-позитивного материала, что может указывать на усиление метаболитических процессов в них, в то время как у детей с неконтролируемым течением заболевания отмечается подавление гликолитического пути расщепления углеводов.
В сложном комплексе функциональных преобразований ЛМ при их активации важная роль принадлежит лизосомальному аппарату и его ведущим компонентам - кислой фосфатазе и пероксидазе (Фрейдлин И.С.,1984.; Ефремов А.В. и др., 2007).
У детей с контролируемым и неконтролируемым течением БА интенсивность цитохимической реакции на кислую фосфатазу оказалась ниже - (Ме; 25-75%) 1,25; 1,03-1,5 у.е. и 1,29; 0,65-1,6 у.е. соответственно) относительно группы сравнения - 1,54; 1,37-1,75 у.е. (рис. 3).
При исследовании интенсивности цитохимической реакции на пероксидазу, которая, наряду с кислородными радикалами и перекисью водорода, составляет эффекторное звено кислородзависимого компонента бактерицидности фагоцитов (Долгушин И.И. и др., 2009) также выявлено ее снижение относительно группы сравнения (рис. 3).
Рис. 3. Интенсивность цитохимической реакции на кислую фосфатазу и пероксидазу в ЛМ исследуемых детей.
Примечание. Значимость различий (p<0,05): * - с группой сравнения.
Общепризнанно, что лизосомальные энзимы обеспечивают переваривание, в основном, убитых микроорганизмов (Фрейдлин И.С.,1989; Цыганкова О.В., и др, 2009). Таким образом, снижение в ЛМ активности пероксидазы и кислой фосфатазы у детей с БА позволяет говорить об угнетении гидролитических процессов в них. Результаты исследования лизосомальной активности ЛМ отражены на рисунке 4.
Рис. 4. Оценка лизосомальной активности ЛМ у исследуемых детей.
Примечание. Значимость различий (p<0,05): * - с группой сравнения, ** - с 1 группой.
Как видно из рисунка, число акридиноранжпозитивных клеток среди ЛМ детей с БА контролируемого (1 группа) и неконтролируемого (2 группа) течения несколько ниже такового в группе сравнения. Наименьшее число акридиноранжпозитивных ЛМ выявлено у детей с неконтролируемым течением БА.
Наиболее важным индикатором лизосомальной активности является индекс, отражающий ее средний уровень из расчета на одну макрофагальную клетку (индекс лизосомальной активности). Установлено, что данный индекс у детей с контролируемым и неконтролируемым течением БА снижен (1,59; 1,4-1,73 и 1,48; 1,34-1,7 против 1,99; 1,95-2,06 в группе сравнения). Наиболее выраженное снижение лизосомальной активности выявлено у детей с неконтролируемым течением легкой персистирующей БА (p<0,05).
Снижение активности пероксидазы и кислой фосфатазы, а также общей лизосомальной активности у детей с БА, особенно при неконтролируемом течении, позволяет предположить у них нарушение бактерицидной функции ЛМ.
В следующей серии исследований проведена оценка кислородзависимого метаболизма ЛМ, который оценивали с помощью спонтанного и стимулированного теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-теста), как одного из характерных и наиболее надежных показателей функциональной активности фагоцитирующих клеток. Согласно современным представлениям, НСТ-тест можно рассматривать как биохимический критерий готовности клетки к завершенному фагоцитозу. Полученные результаты представлены на рис. 5.
Как видно из рисунка, в группах детей с БА интенсивность спонтанного НСТ-теста снижена относительно группы сравнения, что указывает на тенденцию к угнетению кислородзависимой метаболической активности ЛМ.
Активация ЛМ, связанная с процессом фагоцитоза, оценивалась при помощи индуцированного НСТ-теста с использованием микросфер латекса диаметром 1,2 мкм. Данный тест отражает метаболическую активность индуцированных ЛМ.
Как видно из рис. 5, метаболическая активность индуцированных ЛМ у детей с БА контролируемого и неконтролируемого течения несколько снижена относительно группы сравнения. Обращает на себя внимание тот факт, что у детей группы сравнения коэффициент стимуляции НСТ-теста, отражающий отношение индуцированного НСТ-теста к спонтанному НСТ-тесту, в ЛМ составил 1,46; 1,17-1,64 у.е.. В то же время у детей с БА контролируемого и неконтролируемого течения данный коэффициент оказался ниже относительно группы сравнения и составил 1,33; 1,06-1,44 у.е. и 1,39; 1,18-1,55 у.е. соответственно.
Оценивая данные результаты, можно констатировать, что метаболическая активность ЛМ в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте у детей с легкой персистирующей БА контролируемого и неконтролируемого течения снижена относительно группы сравнения.
Рис. 5. Интенсивность спонтанного и индуцированного НСТ-теста в ЛМ исследуемых детей.
Примечание. Значимость различий (p<0,05): * - с группой сравнения.
Согласно современным представлениям, НСТ-тест является наиболее информативным показателем, характеризующим состояние общей адаптации и связанной с ней устойчивости к экстремальным воздействиям (Маянский А.Н., Маянский Д.Н.,1989; Фрейдлин И.С.,1984). В свете этой концепции, выявленное нами у детей с легкой персистирующей БА снижение как спонтанного, так и индуцированного НСТ-теста в ЛМ, можно рассматривать как угнетение антистрессорной резистентности.
Для оценки фагоцитарной активности ЛМ мы определяли фагоцитарный показатель, отражающий процент ЛМ, содержащих частицы латекса, а так же фагоцитарный индекс, отражающий количество частиц латекса в 100 подсчитанных ЛМ в перерасчете на одну клетку. Как видно из табл. 3, в группах детей с БА фагоцитарный показатель практически не отличался от группы сравнения.
Таблица 3
Показатели фагоцитарной активности ЛМ, Ме; 25-75%.
Показатель 1 группа (n=10) 2 группа (n=10) Группа сравнения (n=10)
Примечание. Значимость различий (p<0,05): * - с группой сравнения.
Обращает на себя внимание, что фагоцитарный индекс у детей с контролируемым течением заболевания оказался ниже на 35%, а с неконтролируемым течением БА на 46% относительно группы сравнения. Таким образом, минимальная поглотительная способность ЛМ выявлена у детей с неконтролируемым течением заболевания.
Анализ полученных результатов, позволяет констатировать, что у детей с легкой персистирующей БА имеет место уменьшение количества ЛМ и нарушение их эфферентных функций: угнетение адгезивных свойств и метаболической активности, в том числе кислородзависимого метаболизма, а также депрессия гидролитической и лизосомальной активности, что обусловливает, в конечном итоге, снижение фагоцитарной активности ЛМ. Обращает на себя внимание то, что наиболее выраженные изменения изученных функций ЛМ имеют место у детей с неконтролируемым течением БА.
ВЫВОДЫ
1. При оценке клинико-анамнестических данных детей с бронхиальной астмой, достоверных отличий между группами с контролируемым и неконтролируемым течением выявлено не было. Выявлен ряд причин, приводящих к неточной клинической оценке уровня контроля бронхиальной астмы (в 59% случаев) у детей: неверная трактовка дневных и ночных симптомов, переносимости физической нагрузки, кратности использования препаратов неотложной помощи; нерегулярное проведение спирометрии, отсутствие достоверных данных пикфлоуметрии.
2. Несмотря на проводимую базисную терапию, у 35% детей с контролируемым течением бронхиальной астмы выявлена эозинофилия индуцированной мокроты; при неконтролируемом течении легкой персистирующей бронхиальной астмы у детей с эозинофилией мокроты среднее содержание эозинофилов выше, чем при контролируемом течении (11,5% и 5,5% соответственно).
3. Содержание цитокинов различно во всех исследуемых группах; получены достоверные отличия по большинству цитокинов между группами с бронхиальной астмой и группой сравнения (IGA, IFN-?, MCP-1,IL-1?, IL-8, IGE); достоверных отличий между группами с контролируемым и неконтролируемым течением бронхиальной астмы выявлено не было.
4. Наиболее значимые и статистически достоверные отличия получены при исследовании легочных макрофагов. У детей с легкой персистирующей бронхиальной астмой имеет место уменьшение количества легочных макрофагов и нарушение их эфферентных функций: угнетение адгезивных свойств и метаболической активности, в том числе, кислородзависимого метаболизма; депрессия гидролитической и лизосомальной активности, снижение фагоцитарной активности, особенно у детей с неконтролируемым течением заболевания.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. У детей с бронхиальной астмой для оценки контролируемости заболевания, помимо клинических данных и определения параметров функции внешнего дыхания, необходимо проводить исследование цитологического (а по возможности и иммунологического) состава индуцированной мокроты, так как клинические проявления заболевания не всегда соответствуют воспалительным изменениям слизистой оболочки бронхов, что необходимо учитывать для подбора адекватной базисной терапии.
2. С целью коррекции проводимой медикаментозной терапии детям с бронхиальной астмой, особенно с неконтролируемым течением, необходимо проводить оценку функционального состояния легочных макрофагов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Жаков, Я.И. Применение метода индуцированной мокроты у детей с впервые выявленной бронхиальной астмой: цито-иммунологические особенности / Я.И. Жаков, О.Г. Рыбакова, М.С. Бабайлов // Уральский медицинский журнал. - 2009. - № 7 (61). - С. 34-37.
2. Минина, Е.Е. Изменение цито-иммунологического профиля у детей с бронхиальной астмой, получающих ингаляционные глюкокорткостероиды / Е.Е. Минина, В.С. Ишимова, М.С. Бабайлов, Я.И. Жаков, В.И. Куличков // Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию МУЗ Детской городской клинической больницы № 8 г. Челябинска. - Челябинск: Печать и копия, 2010. - С. 122-125.
3. Бабайлов, М.С. Клинико-лабораторная оценка контролируемости бронхиальной астмы у детей / Е.Е. Минина, М.С. Бабайлов // Материалы I международной (VIII итоговой) научно-практической конференции молодых ученых. - Челябинск: Изд-во ЧЕЛГМА, 2010. - С. 15-16.
4. Тричик, Е.М. Ранняя диагностика респираторных аллергозов с помощью исследования индуцированной мокроты и назального секрета в группе часто болеющих детей / Е.М. Тричик, Ф.Ф. Хайбуллина, Е.Е. Минина, М.С. Бабайлов // Материалы I международной (VIII итоговой) научно-практической конференции молодых ученых. - Челябинск: Изд-во ЧЕЛГМА, 2010. - С. 244-245.
5. Жаков, Я.И. Ранняя диагностика респираторных аллергозов в группе часто болеющих детей / Я.И. Жаков, Е.Е. Минина, М.С. Бабайлов, В.Я. Жаков // Материалы девятого Российского конгресса “Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии”. - М., 2010. - С. 37.
6. Жаков, Я.И. Оценка контролируемости бронхиальной астмы у детей по клинико-лабораторным данным / Я.И. Жаков, М.С. Бабайлов, Е.Е. Минина, А.В. Ленец // Материалы девятого Российского конгресса “Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии”. - М., 2010. - С. 261-262.
7. Жаков, Я.И. Ранняя диагностика аллергических заболеваний легких в группе часто болеющих детей / Я.И. Жаков, Е.Е. Минина, М.С. Бабайлов, В.Я. Жаков // Пульмонология детского возраста: проблемы и решения / под ред. Ю.Л. Мизерницкого, А.Д. Царегородцева. - М., 2010. - Вып. 10. - С. 152-153.
8. Бабайлов, М.С. Возможности метода индуцированной мокроты в оценке контролируемости бронхиальной астмы у детей / М.С. Бабайлов, Е.Е. Минина, Я.И. Жаков // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 2/1 (35). - С. 91-92.
9. Бабайлов, М.С. Функциональная характеристика альвеолярных макрофагов у детей с бронхиальной астмой / М.С. Бабайлов, Г.В. Брюхин, Я.И. Жаков // Вестник Южно-Уральского государственного университета. - 2011. - № 20 (237). - С.89-92. - (Сер. «Образование, здравоохранение, физическая культура»; Вып. 27).
10. Бабайлов, М.С. Влияние кромонов на морфофункциональное состояние бронхоальвеолярных макрофагов детей с бронхиальной астмой / М.С. Бабайлов, Г.В. Брюхин, Я.И. Жаков // Вестник Челябинского государственного педагогического университета. - 2011. - № 5. - С. 348-356.
11. Пат. 2430362 РФ Способ выделения альвеолярных макрофагов из мокроты / Я.И. Жаков, М.С. Бабайлов, Г.В. Брюхин, Е.Е. Минина, В.И. Куличков, В.С. Ишимова. - № 2010138744; заявл. 20.09.2010; опубл. 27.09.2011, Бюл. № 27. - 6 с.
12. Бабайлов, М.С. Цитохимическая характеристика альвеолярных макрофагов у детей с легкой персистирующей бронхиальной астмой / М.С.Бабайлов // Материалы II международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодых ученых. - Челябинск: Изд-во ЧЕЛГМА, 2011. - С. 9-13.
13. Жаков, Я.И. Влияние Лазолвана (Амброксола) на динамику воспалительного процесса слизистой оболочке бронхов после перенесенного острого бронхита у детей по данным индуцированной мокроты / Я.И. Жаков, Е.Е. Минина, М.С. Бабайлов // Русский медицинский журнал. - 2011. - № 22 (19). - С.1361-1364.