Методы учета численности клеток бактерий рода Caulobacter в озере Байкал. Анализ вертикального и сезонного распределения численности популяции бактерий в различных биотопах озера. Идентификация штаммов представителей рода Caulobacter из проб воды.
Аннотация к работе
Исследованию таксономического состава культивируемого гетеротрофного микробиоценоза озера Байкал посвящено множество работ (Максимова, 1989; Дрюккер и соавт., 2000; Парфенова и соавт., 2006). На основе морфологических и молекулярно-генетических признаков гетеротрофные бактерии рода Caulobacter ранее были обнаружены в озере Байкал (Лаптева, 1990; Белькова и соавт., 1996). Лаптева предположила, что бактерии Caulobacter занимают второе место после Pseudomonas по степени распространения и численности, и именно эти две бактериальные группы ответственны за минерализацию растворенного органического материала в водных местообитаниях, причем, бактерии Caulobacter особенно важны, когда концентрация питательных веществ и температура в среде обитания низки (Лаптева, 1987). Цель исследований состояла в изучении особенностей распространения бактерий рода Caulobacter в различных биотопах экосистемы озера Байкал и в разработке олигонуклеотидного зонда для детекции этого рода бактерий. Сравнить методы выделения и учета численности клеток бактерий рода Caulobacter в озере Байкал.В работе использовано 199 проб воды и донных осадков озера Байкал, отобранных из различных биотопов озера в различные сезоны 2003-2006 гг. Пробоотбор производили стандартными методами (Кузнецов и соавт., 1989). Природные образцы воды с разных глубин отбирали, используя батометры, а у дна - стерильными шприцами (аквалангисты). Выделение штаммов бактерий рода Caulobacter осуществляли на различных, разработанных ранее агаризованных питательных средах: PYE, PYE с рибофлавином, РСА, ПДС, R2A (Poindexter, 1981). Исследования морфологии клеток бактерий рода Caulobacter, выделенных из озера Байкал, осуществляли с помощью светового микроскопа CARL ZEISS JENA (Германия), эпифлуоресцентного микроскопа Olympus Т041(Япония), сканирующего электронного микроскопа PHYLIPS SEM 525M и трансмиссионного электронного микроскопа LEO 906E (Германия). Для световой микроскопии препараты бактериальных клеток контрастировали карболовым фуксином основным; в качестве красителя при флуоресцентной микроскопии применяли ДАФИ (4,6-диамино-2-фенилиндол); 2% водный раствор уранилацетата был использован для контрастирования препаратов при трансмиссионной электронной микроскопии; для сканирующего электронного микроскопирования образцы напыляли золотом.В октябре мы наблюдали перераспределение популяции бактерий Caulobacter из придонного слоя воды в верхний слой грунта. Так же, как и в октябре 2004 г., в октябре 2005 г. бактерии Caulobacter предпочитали заселять верхний слой осадка, нежели придонный слой воды. Изучение распространения популяции бактерий Caulobacter в зоне влияния третьей по величине водного стока реки Баргузин проводили на основе проб воды, отобранных в устье реки Баргузин и в Баргузинском заливе в июне 2004 г. В пробах воды на выходе из Баргузинского залива, где глубина составила 1000 м, мы наблюдали бактерии Caulobacter в количестве 25 кл/мл на поверхности воды, 6 кл/мл - на глубине 25 м и на глубине 1000 м бактерии Caulobacter не обнаружены. Сопоставляя данные по пространственному распределению численности бактерий Caulobacter с физико-химическими параметрами вод Баргузинского залива, можно сделать вывод, что бактерии Caulobacter приурочены к высоким концентрациям взвешенных частиц.Для расчета структуры зонда мы использовали последовательности бактериального гена 16S РРНК, принадлежащие к пяти родам семейства Caulobacteraceae: Asticcacaulis, Brevundimonas, Phenylobacterium, Nitrobacteria, Caulobacter. Поэтому, перед нами встала задача - определить принадлежность данных последовательностей к роду Caulobacter. Таким образом, все найденные бактериальные последовательности, которые гипотетически могли бы гибридизоваться с зондом, разделились на две группы: одна группа образовывала общий кластер с последовательностями видов рода Caulobacter, другая группа последовательностей лежала вне этого кластера, то есть не относилась к данному роду. Последовательности неидентифицированных организмов, группирующиеся в один кластер с родом Caulobacter, было принято считать представителями этого рода. Гибридизацию штамма № 83 проводили при следующих строгих условиях реакции гибридизации: 35% формамида в гибридизационном буфере, 0,0 М NACL в отмывочном буфере, отмывка 20 минут; и при 35% формамида в гибридизационном буфере, 0.225 М NACL в отмывочном буфере, отмывка 30 минут (рис.За период исследований 2003-2006 гг. из воды и донных осадков различных биотопов озера Байкал на различных по составу питательных средах выделено 70 штаммов бактерий рода Caulobacter. Исследования сезонной динамики и вертикального распределения показали, что наибольшая численность бактерий Caulobacter наблюдается в верхнем слое осадка и придонном слое воды мелководной литорали Южного Байкала (до 700 000 кл/мл), в устье реки Баргузин (700 000 кл/мл) и в зоне смешения байкальских вод и реки Селенги (130 000 кл/мл). Установлена положительная корреляция между количеством культивируемых гетеротрофных микроорганизмов и