Атомный и молекулярный состав живых организмов. Структурные уровни белков и нуклеиновых кислот. Методы исследования структуры макромолекул. Клеточная теория, структура и свойства биологических мембран. Ядерный аппарат клетки, генетическая информация.
Аннотация к работе
Макеев Александр Владиславович ОСНОВЫ БИОЛОГИИ 1996 и 1997Они обладают почти одинаковыми химическими свойствами, однако молекулы, содержащие легкие изотопы, подвижнее, чем молекулы, содержащие тяжелые изотопы, и химические связи, образуемые тяжелыми изотопами, прочнее, чем такие же связи, образуемые легкими изотопами. Каждая молекула воды в принципе может образовывать водородные связи максимально с четырьмя соседними молекулами, однако при комнатной температуре в любой данный момент каждая молекула воды образует водородные связи в среднем с 3.4 других молекул. В воде растворяются очень многие вещества, причем растворимость некоторых веществ определяется способностью воды образовывать водородные связи с гидроксильными и карбоксильными группами других молекул. Если в среде содержание воды более высокое, чем в клетке, то выравнивание концентрации воды между клеткой и средой происходит путем проникновения воды из среды в клетку. На 1 виток правой а-спирали приходится 3.6 аминокислотных остатка, и шаг спирали составляет 0.54 нм, так что на 1 аминокислотный остаток приходится 0.15 нм; диаметр такой спирали без учета боковых групп - 0.6 нм. а-спираль может быть построена либо из L-, либо из D-аминокислот, но все аминокислоты должны представлять собой стереоизомеры одного и того же типа, так как пептидная цепь, состоящая из смеси остатков L-и D-аминокислот, не способна образовать спираль, и хотя из природных L-аминокислот можно построить как правую, так и левую спираль, правые спирали в белках встречаются намного чаще.Пространственная структура такой молекулы будет полностью описана, если будут определены координаты всех атомов, входящих в эту молекулу. Используя формулу для объема шара, удобно связать rгидр с парциальным удельным объемом макромолекулы vгидр = vмол dvвода, где vвода и vмол - парциальные удельные объемы растворителя (воды) Коэффициент трения можно найти из данных по измерению диффузии макромолекул, молекулярную массу можно определить многими экспериментальными методами (например, равновесным центрифугированием или денатурирующим электрофорезом), форму макромолекул и частиц можно иногда выяснить из данных электронной микроскопии, однако vмол и d, как правило, однозначно определить нельзя и можно лишь оценить их предельные значения (основная сложность здесь состоит в том, что полностью удалить прочносвязанную с макромолекулой воду очень трудно). Проще всего для определения f использовать процесс диффузии, т.е. процесс перемещения молекул из области с высокой концентрацией в область с низкой концентрацией этих молекул при отсутствии движущей силы (беспорядочное тепловое движение), для которого f = KT/D (уравнение Эйнштейна-Сазерленда), где k - константа Больцмана, T - абсолютная температура, а D - коэффициент диффузии. Сила F при ультрацентрифугировании слагается из центробежной силы Fц = mw2R, где m - масса частицы, w - угловая скорость вращения ротора, R - расстояние до центра вращения, и противоположно направленной центростремительной силы выталкивания, которая возникает вследствие вытеснения движущейся частицей молекул растворителя и равна Fцvмолr, где vмол - парциальный удельный объем движущейся частицы, а r - плотность растворителя (под растворителем здесь понимается суспендирующая среда, т.е. если частица находится в воде, то растворителем является вода, а если она находится в NACL с определенной концентрацией, то растворителем будет раствор NACL).Современная клеточная теория включает следующие положения: 1) клетка-основная единица строения и развития всех живых организмов, наименьшая единица живого; 2) клетки разных организмов сходны (гомологичны) по своему строению, химическому составу, основным проявлениям жизнедеятельности и обмену веществ; 3) размножение клеток осуществляется только путем деления (клетка от клетки); 4) в сложных многоклеточных организмах клетки специализированы и образуют ткани; они тесно связаны между собой и включены в единую систему нервной и гуморальной регуляции. С другой стороны, клетки, не могут быть намного больше, чем они есть, потому что в этом случае скорости химических реакций в клетках были бы ограничены скоростью диффузии молекул питательных веществ внутри клетки. При увеличении размеров клеток объем возрастает гораздо быстрее, чем площадь поверхности, что приводит к резкому уменьшению числа молекул питательных веществ на единицу объема, проникших в клетку за единицу времени. Это наблюдается в случаях, когда клетка не осуществляет активные химические превращения, а служит просто как резервуар для запасания и хранения веществ, например, яйцеклетки (у птиц обычно несколько см в диаметре, рекорд - яйцеклетка сельдевой акулы диаметром 22 см) или клетки мякоти плодов (у цитрусовых до 10 мм).
План
ОГЛАВЛЕНИЕ Часть 1 Введение.4
Вывод
Функционирование биологических макромолекул определяется их сложной пространственной архитектурой. Задача определения этой пространственной структуры пока не может быть легко решена ни методами прямого экспериментального определения, ни расчетами по известной первичной последовательности мономеров.
При функционировании биологических молекул существенными оказываются также переходы между разными пространственными структурами (конформациями). При нарушении пространственной структуры (денатурации) макромолекулы переходят в состояние неупорядоченного клубка, описываемого простыми статистическими моделями, но полностью теряют свою биологическую функцию. Модель статистического клубка полезна для оценки размеров макромолекулы.
Сравнительный анализ первичных последовательностей мономеров белков и нуклеиновых кислот из различных организмов позволяет строить классификации, основанные на эволюционных связях между организмами, однако реконструкция эволюционных деревьев по сравнительно-молекулярным данным неоднозначна.
Рис.23. Филогенетическое дерево, построенное на основе данных о числе аминокислотных замен в молекулах цитохрома с у различных живых организмов
Температура Теплопоглощение 5"-конец
3"-акцепторный конец
Увеличенная D-спираль
Основания антикодона
Рис. 13. Двойная спираль ДНК в В- и А-формах: А - оси спиралей в плоскости рисунка; Б - оси спиралей перпендикулярны плоскости рисунка
Величина молярного отношения пар А-Т/G-С геномной ДНК
Частота встречаемости отношения у различных организмов (отн. ед.)
Лекция 3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ МАКРОМОЛЕКУЛ Исследование структуры макромолекул - трение макромолекул в растворе - диффузия макромолекул - ультрацентрифугирование - хроматография белков и нуклеиновых кислот - электрофорез белков и нуклеиновых кислот - спектроскопия поглощения белков и нуклеиновых кислот - другие оптические методы - краткие выводы
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ МАКРОМОЛЕКУЛ
Функционирование биологических макромолекул определяется их пространственной структурой, определение которой представляет собой непростую задачу. В белке или нуклеиновой кислоте средней величины, масса которой составляет 30 КДА, содержится приблизительно 4000 атомов. Пространственная структура такой молекулы будет полностью описана, если будут определены координаты всех атомов, входящих в эту молекулу. Для этого требуется найти примерно 16000 неизвестных параметров. Если исключить из рассмотрения атомы водорода, то это число сокращается наполовину. Задача резко упрощается, если известна первичная структура исследуемой макромолекулы. Чтобы описать относительное расположение двух соседних аминокислотных остатков в полипептидной цепи, достаточно задать два угла, а для описания ориентации боковой цепи каждого аминокислотного остатка нужно в среднем еще 2 параметра. В белке с мол. массой 30 КДА содержится приблизительно 300 аминокислотных остатков, т. е. необходимо определить около 1200 параметров. Для нуклеиновой кислоты той же массы потребуется 800 параметров. Только один метод - рентгеноструктурный анализ - может дать такое количество информации для определения пространственной структуры макромолекулы. Однако это очень трудоемкий метод, применение которого связано с рядом ограничений и не всегда дает достаточно хорошее качество данных, чтобы на их основе можно было найти точные координаты атомов.
К счастью, многие вопросы, связанные с функционированием биологических молекул, можно решить, рассматривая их структуру не на уровне атомного разрешения, а с гораздо меньшей точностью, или исследуя лишь небольшую, но наиболее важную в функциональном отношении часть молекулы. Непосредственно увидеть какие-либо структурные особенности макромолекул можно лишь с помощью туннельного сканирующего микроскопа, о котором будет рассказано в следующей лекции. Поэтому сведения о размерах и форме макромолекул получают различными косвенными методами, многие из которых были специально разработаны для исследования биологических макромолекул. Каждый из этих методов имеет свои преимущества, но и свои ограничения, которые необходимо сознавать, для того чтобы правильно интерпретировать полученные этим методом данные. Рассмотрим некоторые из этих методов.
ТРЕНИЕ МАКРОМОЛЕКУЛ В РАСТВОРЕ
Движение молекул в жидкости происходит со значительно меньшей скоростью, чем в газовой фазе, изза сил трения между молекулами в конденсированной фазе. Уравнение движения молекулы с массой m под действием силы F в вакууме описывается формулой F = ma = m(dv/dt), где v - скорость молекулы. Реально в жидкости на любую движущуюся частицу действует тормозящая сила трения. Если скорость движения не столь велика, чтобы вызвать турбулентность, то сила трения должна быть пропорциональна скорости. В результате уравнение поступательного движения принимает вид F-fv = m(dv/dt), где параметр f - коэффициент трения. Это линейное дифференциальное уравнение легко решается, и, если скорость макромолекулы в начальный момент времени равна vo и параллельна приложенной силе, а F = const, то решение имеет вид v(t) = (F/f) [vo-(F/f)]exp(-ft/m). Из этого решения следуют два важных вывода: 1) скорость частицы изменяется лишь в течение очень короткого отрезка времени после того, как приложена внешняя сила; 2) скорость уменьшается экспоненциально от начальной величины vo до постоянной конечной величины v($) = F/f, которая пропорциональна приложенной силе. Время достижения постоянной скорости для макромолекул весьма мало. Для обычной макромолекулы, имеющей мол. массу 30 тыс. Да, значение f порядка 5710-8 г/с, а m равна 5710-20 г. Поэтому переменный член exp(-ft/m) в уравнении движения молекулы становится пренебрежимо малым уже через 10-12 с.
Коэффициент трения f зависит от вязкости жидкости (h), а также от размеров и формы движущейся макромолекулы (частицы). Наиболее простая зависимость, называемая законом Стокса, выполняется для поступательного движения сферической частицы. При этом обычно рассматривают два предельных граничных условия потока жидкости у поверхности молекулы. В первом из них полагают, что слой жидкости, соприкасающийся с поверхностью частицы, движется со скоростью частицы. Такую смачиваемую поверхность называют липкой, и в этом случае f = 6phr, где r - радиус частицы. В другом предельном случае граничных условий предполагается отсутствие взаимодействия между частицами и молекулами жидкости; жидкость просто скользит по поверхности частицы, обтекая ее. Для таких граничных условий f = 4phr. Однако, как было показано в предыдущей лекции в разделе "Растворимость белков и нуклеиновых кислот", всегда наблюдается сильное связывание молекул обычных растворителей (например, воды) с биополимерами. Поэтому на практике реализуется случай липкой поверхности, а радиус молекулы r в выражении закона Стокса должен быть заменен на радиус гидратированной молекулы rгидр (см. задачу
10).
Большинство биологических молекул не имеет сферической формы. Биологические молекулы в основном представляют собой компактные, глобулярные, часто несимметричные твердые частицы. Поэтому следующим приближением для описания их формы является эллипсоид вращения, сплющенный или вытянутый (рис. 24). Сплющенный эллипсоид имеет дискообразную форму, образованную вращением эллипса вокруг короткой полуоси b; обе его длинные полуоси одинаковы. Вытянутый эллипсоид имеет стержнеобразную форму, образованную вращением эллипса вокруг длинной полуоси a; его короткие полуоси b одинаковы. При равных объемах поверхность любого эллипсоида больше, чем поверхность сферы, поэтому эллипсоиды имеют больший коэффициент трения, чем сфера равного объема. Для граничных условий липкой поверхности можно получить аналитическое выражение зависимости коэффициента трения эллипсоида от соотношения полуосей, аналогичное закону Стокса. Однако оно весьма громоздко, и на практике используют численные значения отношения коэффициента трения эллипсоида (f) к коэффициенту трения сферы того же объема (fсф) F = f/fсф, называемое фактором формы или фактором Перрена (таблица 4). Одно и то же значение величины F соответствует многим возможным формам макромолекулы, две из которых являются эллипсоидами вращения, поэтому неопределенность в описании формы с помощью F очень велика. Однако в предельном случае, при больших значениях величины F, можно уверенно считать частицу вытянутой, так как дискообразная частица с F > 1.5 должна иметь ничтожную величину малой полуоси, что нереально. При очень малых значениях F поступательные коэффициенты трения вытянутого и сплющенного эллипсоидов практически не различаются, хотя, как это видно из рис. 24, вытянутый и сплющенный эллипсоиды (оба с a/b = 2) являются совершенно различными физическими объектами.
Таким образом, в приближении эллипсоида вращения f =
6PHRГИДРF. Используя формулу для объема шара, удобно связать rгидр с парциальным удельным объемом макромолекулы vгидр = vмол dvвода, где vвода и vмол - парциальные удельные объемы растворителя (воды)
Таблица 4 Численные значения фактора Перрена для вытянутого и сплющенного эллипсоидов вращения.
и полностью дегидратированной (безводной) молекулы, а d - степень гидратации (количество воды в г на 1 г сухого вещества): rгидр = [(3/4p)(M/NA)(vмол dvвода)] , где M - молекулярная масса, а NA
1/3
- число Авогадро. Парциальный удельный объем - это увеличение объема, вызываемое прибавлением к раствору единицы массы растворяемого вещества. vвода - это просто величина, обратная плотности чистой
3 воды (1 см /г), следовательно, коэффициент трения является функцией
4-х переменных, а именно: удельного парциального объема безводной молекулы, соотношения полуосей эллипсоида (фактора формы), молекулярной массы и степени гидратации. Коэффициент трения можно найти из данных по измерению диффузии макромолекул, молекулярную массу можно определить многими экспериментальными методами (например, равновесным центрифугированием или денатурирующим электрофорезом), форму макромолекул и частиц можно иногда выяснить из данных электронной микроскопии, однако vмол и d, как правило, однозначно определить нельзя и можно лишь оценить их предельные значения (основная сложность здесь состоит в том, что полностью удалить прочносвязанную с макромолекулой воду очень трудно). Ясно, что дальнейшее уточнение геометрической формы макромолекул и представление их как тел более сложных, чем эллипсоиды вращения, резко увеличивает число неизвестных параметров, делая невозможной интерпретацию экспериментальных данных по перемещению макромолекул в растворе.
Задача 11. Используя модель свободно-сочлененной цепи, рассчитайте коэффициент трения fсф полностью денатурированного белка с мол. массой 30 КДА, представляющего собой беспорядочный клубок, невзаимодействующий с молекулами растворителя. Сравните с fсф, рассчитанным исходя из данных задачи 10.
ДИФФУЗИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ
В предыдущем разделе было показано, что для того чтобы получить информацию о размере и форме макромолекулы можно использовать коэффициент трения f между макромолекулой и молекулами растворителя. Проще всего для определения f использовать процесс диффузии, т.е. процесс перемещения молекул из области с высокой концентрацией в область с низкой концентрацией этих молекул при отсутствии движущей силы (беспорядочное тепловое движение), для которого f = KT/D (уравнение Эйнштейна-Сазерленда), где k - константа Больцмана, T - абсолютная температура, а D - коэффициент диффузии.
Коэффициент диффузии макромолекул обычно измеряют путем создания границы между буфером и раствором макромолекул с известной концентрацией, наблюдая уширение этой границы во времени. Хотя это измерение выглядит очень простым, практическое его применение связано с большими экспериментальными трудностями. Константы диффузии макромолекул имеют порядок от 10-7 до 10-6 см2/с, поэтому для получения измеряемого уширения требуется много часов. В течение всего этого времени система не должна испытывать никаких механических воздействий, а точный контроль температуры должен исключить термическую конвекцию. Если макромолекула заряжена, то наличие в растворе низкомолекулярных ионов, которые диффундируют быстрее, чем макромолекула, приводит к образованию градиента электрического потенциала, который начинает влиять на движение макромолекул. Отсюда следует, что измерение коэффициента диффузии надо проводить в изоэлектрической точке или в растворе с достаточно высокой ионной силой, чтобы нейтрализовать влияние возникающего электрического поля. Кроме того, поскольку теория диффузии основана на допущении о независимом движении молекул (т.е. они не должны взаимодействовать), необходима экстраполяция до бесконечно большого разбавления.
Другой метод основан на измерении возникающего вследствие эффекта Доплера отличия частоты светового луча лазера от частоты рассеянного света, отраженного диффундирующими молекулами. Этот сдвиг частоты связан с D простой зависимостью и обеспечивает точность измерений до 1%. Однако метод не пригоден для определения D молекул с очень большой длиной цепи. В настоящее время нет удовлетворительных методов для измерения D больших несферических молекул, таких как ДНК, поскольку в этих случаях значение D очень мало.
Коэффициент диффузии молекулы должен быть функцией температуры, при которой проводятся измерения. Он зависит также от вязкости растворителя, а она в свою очередь также является функцией температуры. Вместо того чтобы иметь дело со всеми этими зависимостями, обычно приводят значения измеренных констант диффузии к той величине, которая была бы получена при 20ОС в чистой воде: D20,w/D=(293/T)(hw,T/hw,20)(hp,T/hw,T), где D20,w - константа диффузии в чистой воде при 20 С, Т - абсолютная температура в опыте, hw,20 - вязкость чистой воды при температуре 20 С, hw,T - вязкость чистой воды при температуре Т, hp,T - вязкость исследуемого раствора при температуре Т. o o
В таблице 5 приведены характерные значения коэффициентов диффузии D20,w для веществ и частиц, молекулярные массы которых лежат в интервале от меньших, чем 100Да, до больших чем 107Да. Как видно из таблицы, значения коэффициентов диффузии лежат гораздо в более узком интервале, чем молекулярные массы.
Для белков относительно легко определить их мол. массу и измерить коэффициент диффузии. Поскольку значения плотности безводных белков и степень их гидратации лежат довольно в узких пределах от
1.33 до 1.45 г/см3 и от 0.3 до 0.4 г Н О на 1 г белка соответственно, то можно использовать их средние значения - 1.37 г/см3 (vмол = 1/1.37 = 0.73 см3/г) и 0.34 г Н2О /г белка - для оценки формы белковой молекулы с помощью фактора Перрена. Результаты некоторых таких расчетов показаны на рис. 25.
2
Задача 12. Для данного белка определили D20,w = 3.7710-7 см2/с и M = 30 КДА. Принимая удельный парциальный объем безводного белка равным 0.73 см /г, рассчитайте а) rгидр для сферической молекулы белка; б) степень гидратации d такой сферической молекулы; в) отношение осей для гидратированной (d = 0.34) молекулы белка, имеющей форму вытянутого эллипсоида. hw,20 = 0.01 г7с-17см-1.
3
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Крупные частицы, суспендированные в воде, оседают на дно под действием силы тяжести, если их плотность выше плотности растворителя. Однако хотя плотность биологических макромолекул намного выше плотности воды, они остаются во взвешенном состоянии в растворе сколь угодно долго, так как гравитационной силе в этом случае успешно противостоит тепловое движение (диффузия).
Задача 13. Сравните величины гравитационной (потенциальной) энергии макромолекулы с мол. массой 100 КДА (Еграв= mgh) между двумя точками, отстоящими друг от друга на h = 1 см, и тепловой энергии (Етепл=KT) той же самой молекулы при 20 С. о
Для усиления гравитационной составляющей скорости движения макромолекул применяют седиментацию с помощью ультрацентрифуги. Седиментация - это общий термин для обозначения движения в поле центробежной силы. Измерение движения молекул вдоль направления действия центробежной силы называется определением скорости седиментации, в результате чего рассчитывается коэффициент седиментации, значение которого дает информацию о молекулярной массе и форме частицы. Когда создаются такие условия центрифугирования, при которых распределение частиц вдоль центрифужной пробирки не изменяется во времени, т.е. частицы достигли седиментационного равновесия, то этот метод равновесного ультрацентрифугирования дает сведения о молекулярной массе и плотности частиц.
При конструировании ультрацентрифуг - приборов, в которых исследуемый раствор вращается со скоростями вплоть до 70 тыс. оборотов/мин, было проявлено немало изобретательности (рис. 26). При обычно используемых скоростях трение между вращающимся ротором и воздухом может вызвать недопустимый разогрев ротора. Поэтому в камере, в которой вращается ротор, необходимо создать высокий вакуум. Чтобы избежать конвекционного перемешивания, температура исследуемого образца должна поддерживаться на постоянном уровне с довольно высокой точностью, а это может оказаться нелегкой задачей. Силы, которые развиваются внутри ротора, огромны, и случается, что при больших скоростях ротор разлетается на куски. Чтобы эти осколки не разлетелись, камеру с находящимся в ней ротором должны окружать толстые стальные защитные цилиндры. Крайне важно, чтобы ротор был механически сбалансирован. Допустим, что массы двух ячеек с веществом, расположенных симметрично относительно оси ротора, различаются на 1 мг. При 400 000 g возникшая за счет этого разность сил, действующих на ротор, составит 400 г. Это весьма ощутимая сила, которая приведет к вибрации ротора. Но, как ни важно уравновесить ячейки ротора, этого нельзя сделать идеально. Поэтому в любой ультрацентрифуге используется гибкий вал, чтобы ротор мог сам найти точное положение своего центра масс и вращаться вокруг оси, проходящей через этот центр. Это позволяет уравновешивать образцы с допуском
0.5г без нежелательных последствий.
Как было показано в разделе "Трение макромолекул в растворе", скорость макромолекулы, на которую действует постоянная сила F, в растворе очень быстро достигает постоянной конечной величины v($) = F/f. Сила F при ультрацентрифугировании слагается из центробежной силы Fц = mw2R, где m - масса частицы, w - угловая скорость вращения ротора, R - расстояние до центра вращения, и противоположно направленной центростремительной силы выталкивания, которая возникает вследствие вытеснения движущейся частицей молекул растворителя и равна Fцvмолr, где vмол - парциальный удельный объем движущейся частицы, а r - плотность растворителя (под растворителем здесь понимается суспендирующая среда, т.е. если частица находится в воде, то растворителем является вода, а если она находится в NACL с определенной концентрацией, то растворителем будет раствор NACL). Следовательно, v($) = mw2R (1 - vмолr)/f. Скорость молекулы пропорциональна величине центробежной силы, и коэффициент пропорциональности зависит только от свойств движущейся частицы и растворителя. Он обозначается s и называется коэффициентом седиментации: s = v($)/w2R = m(1-vмолr)/f. Заменяя m на M/NA, где M - молекулярная масса, а NA - число Авогадро, и используя уравнение Эйнштейна-Сазерленда f = KT/D, получаем уравнение Сведберга: s = MD(1-vмолr)/KNAT = MD(1-vмолr)/RT, где R - газовая постоянная. Коэффициент седиментации обычно имеет величину порядка 10 с, поэтому эту величину принимают за единицу седиментации и называют сведбергом (S) в честь разработчика и конструктора первой ультрацентрифуги Т. Сведберга (T. Svedberg, 1923): 1S = 1710-13 с.
-13
Также как и в случае с коэффициентом диффузии, изза сложных температурных зависимостей коэффициент седиментации приводят к той величине, которая была бы получена при 20ОС в чистой воде: s20,w/s= = [(1-vмолrw,20)/(1-vмолrp,T)](hw,T/hw,20)(hp,T/hw,T), где s20,w - коэффициент седиментации в чистой воде при 20 С, Т - абсолютная температура в опыте, rw,20 - плотность воды при 20 С, rp,T - плотность растворителя при температуре T, hw,20 - вязкость чистой воды при температуре 20 С, hw,T - вязкость чистой воды при температуре Т, hp,T - вязкость исследуемого раствора при температуре Т. В таблице 6 приведены определенные опытным путем типичные значения s20,w. o o o
Коэффициент седиментации определяют измеряя с помощью специальной оптической системы скорость перераспределения макромолекул в центрифужной пробирке непосредственно в ходе ультрацентрифугирования. Хотя теоретически значение коэффициента седиментации при одной и той же температуре должно быть постоянным для частицы в данном растворителе, на практике для макромолекул s оказывается зависящим от концентрации макромолекул, скорости центрифугирования и ионной силы растворителя. Как правило, наблюдается уменьшение наблюдаемой скорости седиментации с увеличением концентрации макромолекул, связанное с нелинейным увеличением вязкости раствора и с увлечением крупными макромолекулами за собой молекул растворителя и других более медленно седиментирующих молекул (эффект Джонстона-Огстона). Увеличение скорости центрифугирования приводит к увеличению измеряемого значения s и связано с тем, что при большой скорости крупная макромолекула оставляет после себя след (подобный кильватерной струе, образующейся при движении корабля), увеличивающий скорость движения макромолекул непосредственно позади нее. Часто такой процесс сопровождается агрегированием макромолекул и изменением их формы, что тоже приводит к увеличению s. Поскольку макромолекулы заряжены, то при низкой ионной силе нейтрализующие ионы, седиментирующие медленнее, чем макромолекулы, отстают, и это приводит к возникновению тормозящего макромолекулы электрического поля. Это осложнение легко устраняется использованием избытка противоионов при высокой ионной силе. Измерив s20,w и D20,w, можно по уравнению Сведберга рассчитать молекулярную массу макромолекулы. Учтя все перечисленные выше зависимости, значение s для ДНК можно измерить с точностью до 2%, что приводит к получению значения M с ошибкой в 4%, а для белков s может быть измерен с точностью до 1%, что дает ошибку в определении M, равную примерно 1.5%. Если для макромолекулы известны s20,w, D20,w и M, то из уравнения Сведберга можно рассчитать ее vмол.
Гораздо более точно определять молекулярную массу макромолекул (ошибка не превышает 1%) позволяет метод седиментационного равновесия, заключающийся в том, что центрифугирование проводится при относительно низкой скорости, при которой седиментация макромолекул настолько медленна, что уравновешивается диффузией. В этом случае отпадает необходимость определения коэффициента диффузии, но для достижения равновесия обычно требуется не менее суток. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности растворителя является чрезвычайно эффективным методом разделения макромолекул. Здесь равновесие устанавливается в градиенте плотности тяжелой соли типа CSCL. Данная макромолекула в таком растворе либо всплывает, либо погружается, пока не достигнет изопикнической точки, в которой плотность растворителя равна плавучей плотности макромолекулы (которая не совпадает с плотностью собственно макромолекул изза сложных термодинамических эффектов). Если плотность раствора линейно изменяется на небольшом расстоянии, то макромолекулы с данной молекулярной массой оказываются в узкой зоне с центром в изопикнической точке и шириной, обратно пропорциональной корню квадратному из значения молекулярной массы. Большое достоинство этого метода состоит в том, что после разделения компонентов смеси макромолекул пробы раствора можно отбирать на разной высоте центрифужной пробирки и определять содержание в них исследуемых компонентов химически (и, следовательно, очень селективно).
Задача 14. Используя данные таблиц 5 и 6, рассчитайте vмол для рибонуклеазы, гемоглобина и фибриногена. rw,20 = 1 г/см .
3
Задача 15. Фермент рибонуклеотидредуктаза с s20,w = 9.7 S полимеризуется в неактивную форму с s20,w = 15.5 S. Рассчитайте вероятное число мономерных молекул в составе полимера, если факторы Перрена как мономера, так и полимера мало отличаются от 1.
ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Принцип хроматографии состоит в том, что вещества помещают в систему, которая содержит два физически различных компонента - подвижную и неподвижную фазы, и в которой разделение по типам молекул происходит за счет различий (часто весьма незначительных) в распределении между этими двумя фазами. Относительная подвижность каждой молекулы зависит от соотношения между движущей силой (движение подвижной фазы) и силами удерживания (распределение и адсорбция). Когда эффекты адсорбции невелики, то говорят о распределительной хроматографии, а когда адсорбция является главным процессом, приводящим к разделению веществ, то об адсорбционной хроматографии.
К распределительной хроматографии относятся колоночная хроматография, хроматография на бумаге и тонкослойная. Колонкой служит трубка, заполняемая неподвижной фазой и растворителем. Когда неподвижная фаза состоит из мелких частиц инертного материала, который содержит маленькие поры, хроматография называется гель-проникающей или молекулярно-ситовой хроматографией. Если раствор, содержащий молекулы различной величины, пропускать через такую неподвижную фазу, то молекулы, размер которых превышает размер пор, будут двигаться только в пространстве между частицами и поэтому не будут задерживаться неподвижной фазой. Однако молекулы, размеры которых меньше размера пор, диффундируют в частицы и обратно, причем вероятность этого повышается с уменьшением их размера, т.е. их движение вдоль неподвижной фазы замедляется (рис. 27). Если материал частиц в неподвижной фазе (гель) не адсорбирует движущиеся с раствором молекулы, то вероятность проникновения молекул в поры является основным фактором, определяющим скорость их движения вдоль неподвижной фазы. Следовательно, молекулы вымываются из неподвижной фазы в порядке уменьшения их размера или, если форма их относительно похожа (например, глобулярная или линейная), то в порядке уменьшения молекулярной массы. Для различных типов гелей установлено, что зависимость параметра К = (Ve-Vo)/Vs от LGM практически линейна для всех молекул, исключая очень большие и очень маленькие. Здесь Ve - объем растворителя, требуемый для вымывания интересующего соединения, Vo
- "холостой" объем, необходимый для вымывания соединения, которое не проникает в неподвижную фазу, Vs - объем неподвижной фазы и M - молекулярная масса. Таким образом, для определения M достаточно пропустить через неподвижную фазу несколько типов молекул с известной молекулярной массой, по полученным данным построить прямую линию, после чего M образца можно определить интерполяцией. Такой хроматографический метод используется для глобулярных белков и многих углеводов, позволяя определять их M с точностью около 10%. Однако более тщательный теоретический анализ приводит к линейной зависимости К от lgrгидр, где rгидр - эффективный радиус гидратированной молекулы. Это та самая величина, которая получалась бы из диффузионных измерений, если бы мы, никак не учитывая форму молекулы, просто формально применили бы закон Стокса: KT/D = f = 6phrгидр. Линейная зависимость К от lgrгидр лучше согласуется с экспериментальными данными, чем зависимость К от LGM. Результаты, полученные с помощью гель- проникающей хроматографии, можно скомбинировать с измерениями коэффициента седиментации, что позволяет точнее определять молекулярную массу. Как метод гель-проникающая хроматография полезна также при изучении систем взаимодействующих молекул.
Однако основное применение гель-проникающей хроматографии
- разделение веществ. Она находит широкое применение для очистки белков, в частности ферментов, и нуклеиновых кислот.
В случае хроматографии на бумаге неподвижной фазой служит целлюлоза в виде листов бумаги. Движение растворителя по бумаге обеспечивают капиллярные силы. С растворителем двигаются и растворенные вещества, каждое со своей скоростью, определяемой природой вещества, сортом бумаги и природой растворителя. Как только фронт растворителя приблизится к противоположному концу бумаги, его высушивают. Разделенные вещества располагаются пятнами и различаются по их относительному расположению на бумаге. Хроматография на бумаге позволяет осуществлять двумерную хроматографию: после проведения хроматографии в одном направлении бумагу высушивают и затем повторно хроматографируют под прямым углом к направлению первоначального движения растворителя с использованием другого растворителя. При этом часто происходит разделение веществ, которые не разделяются в первом растворителе. Важным применением хроматографии на бумаге в исследовании белков является метод пептидных карт. Если белок подвергать расщеплению в стандартных условиях с использованием набора различных специфических протеиназ (ферменты, разрывающие пептидные связи только после определенной аминокислоты или класса аминокислот), в качестве продуктов образуются небольшие пептиды. Пептиды можно затем разделить с помощью двумерной хроматографии на бумаге, получая при этом распределение пятен, которое практически никогда не совпадает для различных белков. Такая пептидная карта называется "отпечатками пальцев" (fingerprinting) (рис. 28). Метод пептидных карт можно использовать для идентификации выделенного белка, для установления изменений аминокислотного состава в мутантном белке (если замена аминокислоты не влияет на место разрыва связи протеиназой, на пептидной карте будет исчезать одно пятно, вместо которого будет появляться другое; если замена приводит к изменению места разрыва связи, изменят свое положение сразу несколько пятен) или для доказательство того, что белок А является продуктом расщепления большего белка Б или получается в результате преждевременного обрыва цепи аминокислотной последовательности (если на пептидной карте белка А имеются все те же пятна, что и на пептидной карте белка Б, весьма вероятно, что белок А является частью аминокислотной последовательности белка Б).
Тонкослойная хроматография принципиально ничем не отличается от бумажной, но позволяет использовать большое разнообразие материалов для неподвижной фазы. Частицы неподвижной фазы могут быть менее 0.1 мм, поэтому соотношение поверхность/объем очень велико (большая активная поверхность). Активная поверхность в колоночной хроматографии намного меньше, чем в тонкослойной хроматографии, так как слишком мелкие частицы спрессовываются под действием силы тяжести в колонке, что приводит к уменьшению скорости движения жидкости, а это крайне нежелательно изза размывания зон за счет диффузии при очень малой скорости потока. При этом пятна в тонкослойной хроматографии получаются меньше, чем в бумажной хроматографии, и, следовательно, возрастают разрешающая способность и чувствительность (для тонкослойной хроматографии требуется в 50-100 раз меньше вещества для разделения, чем для бумажной: для аминокислот - в 10 раз меньше, для нуклеотидов - в 100 раз меньше). С помощью тонкослойной хроматографии можно обнаружить вещество в количестве до 1нмоля.
К абсорбционной хроматографии относятся ионообменная и аффинная хроматография. Принцип ионообменной хроматографии состоит в том, что заряженные молекулы за счет электростатического взаимодействия обратимо адсорбируются твердой неподвижной фазой, несущей заряженные группы и называемой ионообменником. Разделение на ионообменниках обычно проводится в две стадии: сперва соединение, которое требуется отделять, связывается с ионообменником в условиях образования стабильной связи, затем ионообменник промывают буфером с другим значением РН или с другой ионной силой, в результате чего компоненты буфера конкурируют со связанным веществом за связывающие центры и вызывают его вымывание из ионообменника. Ионообменную хроматографию часто используют для разделения белков, полисахаридов, нуклеотидов, аминокислот и других биологически важных небольших молекул. Но наиболее специфическим "биологическим" методом хроматографии является аффинная хроматография, которая использует относительно слабое обратимое взаимодействие (биологическое сродство) между выделяемым веществом и специфически связывающейся с ним молекулой (лигандом). Такие силы действуют, например, между ферментом и его субстратом или ингибитором, антигеном и антителом, гормоном и рецептором и т.д. Для осуществления фракционирования по биологическому сродству, т.е. методом аффинной хроматографии, один из "партнеров" такой пары ковалентно "пришивается" к частицам неподвижной фазы, а сорбцией и вымыванием второго "партнера" управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в промывающий раствор солей, мочевины, детергентов, конкурирующих за связывание молекул или путем изменения его РН.
Задача 16. При проведении гель-проникающей хроматографии объем растворителя, требуемый для вымывания из колонки высокомолекулярного полисахарида голубого декстрана, который не проникает внутрь геля, составил 78 мл, а объемы растворителя для вымывания белков фибриногена, каталазы и яичного альбумина составили 86, 118 и 172 мл соответственно. Используя данные таблицы 5, оцените M и rгидр для фермента каталазы.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Если молекула обладает суммарным зарядом q и находится в однородном электрическом поле E, то на нее действует сила F = QE. Как было показано в разделе "Трение макромолекул в растворе", скорость макромолекулы, на которую действует постоянная сила F, в растворе очень быстро достигает постоянной конечной величины v($) = F/f = QE/f. Однако такое упрощенное описание электрофореза (т.е. явления переноса заряженных частиц под действием электрического поля) хотя и приводится во многих учебниках, совершенно не соответствует реальной картине. Прежде всего возникает неопределенность с суммарным зарядом макромолекулы, который зависит от ионной силы раствора. При малом количестве противоионов макромолекула будет стремиться перемещаться в одну сторону, а противоионы - в другую. Энергия, которую пришлось бы затратить на преодоление электростатического притяжения при разделении зарядов, чрезвычайно велика, поэтому реально происходящая миграция макромолекул будет незначительна. При избытке противоионов электролит образует ионную атмосферу вокруг полимера, и для того, чтобы учесть этот эффект, можно использовать два подхода. При одном подходе считают, что ионная атмосфера уменьшает эффективный суммарный заряд макромолекулы. При другом полагают, что ионная атмосфера порождает электрическое поле, в котором находится макромолекула и которое следует учитывать наравне с внешним полем. Принято описывать эту атмосферу с помощью непрерывного распределения, игнорируя дискретный характер зарядов. Далее за счет движения макроиона и малых ионов ионное облако постоянно деформируется. Учет всех эффектов представляет собой очень трудную задачу. В результате, существующая теория электрофореза, несмотря на всю ее сложность, не в состоянии удовлетворительно объяснить экспериментальные данные по электрофорезу.
Несмотря на сложность теории, электрофорез является действенным и удобным средством анализа белков и нуклеиновых кислот, если не требовать от него количественных данных о структуре молекул. Все теории согласованно предсказывают, что подвижность прямо пропорциональна отношению суммарного заряда к коэффициенту трения. Такая зависимость позволяет использовать электрофорез для получения информации об относительной величине заряда (для молекул, которые имеют одинаковые размеры и форму) или об относительных размерах (для молекул с одинаковыми зарядами). Существуют, однако, две