Вибір кондуктометричних перетворювачів для створення ферментних біосенсорів. Оптимізація характеристик лабораторного прототипу глюкозного кондуктометричного біосенсора. Протоколи експериментального визначення концентрацій глюкози в реальних зразках.
Аннотация к работе
Потреби сучасної медицини, екології та біотехнології вимагають створення нових аналітичних систем, що мають високу специфічність та чутливість і разом з тим є дешевими, простими у використанні та компактними. Попередні роботи співробітників нашого Інституту показали перспективність використання перетворювачів, виготовлених за технологією мікроелектроніки, а саме РН-чутливих польових транзисторів [Солдаткин и др., 1993] і кондуктометричних планарних електродів [Дзядевич и др., 1993], але широке використання їх на практиці лімітується рядом недоліків. Таким чином, актуальним для усунення вищевказаних недоліків та можливості практичного використання розроблених раніше лабораторних прототипів біосенсорів є проведення детального дослідження факторів, що покращують ефективність роботи як електронного перетворювача, так і самого біосенсора, оптимізуючи при цьому основні аналітичні характеристики його роботи. Дисертаційна робота виконувалась в рамках бюджетної теми Інституту молекулярної біології та генетики № 2.2..4.22 "Розробка наукових засад створення біосенсорів на основі кондуктометричних перетворювачів", конкурсних проектів № 5.4/74 "Вивчення молекулярних аспектів рецепторних взаємодій у біоелектронних системах" Управління фундаментальних досліджень та № 02.12/01962 "Розробка біосенсорів нового покоління для аналізу та контролю біотехнологічних процесів" Департаменту науково-прикладних програм Міністерства України з питань науки та технологій та Міжнародного NATO-Linkage гранта ENVIR.LG 950913. Вперше розроблено лабораторний прототип ферментного сенсора для визначення пеніциліну на основі кондуктометричних планарних електродів, і проведено порівняльний аналіз його робочих характеристик з аналогічними параметрами сенсору на основі РН-чутливих польових транзисторів.У роботі використовували реактиви: b-глюкозооксидаза (ГОД) з Penicillium vitale (КФ 1.1.3.4, виробництво Косарського спиртзаводу Черкаського виробничого обєднання спиртової промисловості, Україна) з активністю 168 од.акт./мг., каталаза з печінки бика (КФ 1.11.1.6, виробництво фірми "Sigma", Франція) з активністю 19.9 од.акт./мг., пеніциліназа з Bacillus cereus (КФ 3.5.2.6, виробництво фірми "Sigma", США) з активністю 2150 од.акт./мг; сироватковий альбумін бика (БСА) (виробництво фірми "Boehringer Mannheim", Франція), 20 % розчин глутарового альдегіду (ГА) (виробництво фірми "Merck", Німеччина), натрієва сіль бензилпеніциліну (500000 од., виробництво Київського заводу медпрепаратів), фериціанід калію K3[Fe(CN)6] (виробництво фірми "Merck", Німеччина), глюкоза (виробництво фірми "Sigma", Франція); полімери для створення додаткових мембран: полівінілбутираль (ПВБ) та політетрагідрофуран (ПТГФ) (виробництво фірми "Aldrich Chem. Co.", США), нафіон-перфторований іонообмінний полімер (5 % розчин в суміші аліфатичних спиртів що містить 10 % води), (виробництво фірми "Aldrich Chem. Co.", США, продукт № 27.470-4), співполімер (4-вінілпіридину зі стиролом) - іонообмінний полімер (ПВКС) (виробництво фірми "Aldrich Chem. Як буферні системи використовували КН2РО4-NAOH фірми "Merck" (Німеччина), тріс-HCL фірми "Reanal (Угорщина) та універсальний буфер [Soldatkin et al., 1994]. Інші реактиви, що використовувались в роботі, були вітчизняного та закордонного виробництва та мали кваліфікацію "ос. ч." та "х. ч.".При нанесенні на його поверхню біоселективної мембрани датчик перетворюється в кондуктометричний біосенсор, який схематично представлено на Рис.2а, а фізико-хімічні процеси, що протікають в електрохімічній комірці з ним, в загальному випадку моделюються еквівалентною схемою, яку представлено на Рис. Він складається з двох однакових ємностей См-р, що відповідають за межу розподілу мембрана/розчин, та опору Rрозч, що моделює провідність розчину поза мембраною. Він складається з двох однакових поверхневих імпедансів Zпов, що відповідають за межу розподілу електрод/розчин; двох однакових ємностей Сокисл, що моделюють процес окислення матеріалу електродів; опору Rm, що моделює провідність розчину всередині мембрани. В процесі реакції ферментативного гідролізу пеніциліну під дією пеніцилінази в мембрані утворюються додаткові іони, які призводять до зміни як РН розчину, так і його провідності, що дозволяє використовувати для вимірів обидва типи перетворювачів [Архипова и др., 1996]. В основі роботи кондуктометричного біосенсора для визначення глюкози лежить реєстрація зміни концентрації протонів, яка має місце в результаті диссоціації глюконової кислоти, яка утворюється в мембрані при окисленні глюкози за допомогою ГОД за схемою: Раніше розроблений біосенсор [Shulga et al., 1993] мав область лінійної залежності величини відгуку сенсора від концентрації субстрату 0,1 - 1,5 ММ.Проведено детальне вивчення впливу різних факторів на роботу кондуктометричних ферментних біосенсорів та оптимізовано їх основні аналітичні характери