Рекомбінантні бакуловіруси, що забезпечують експресію рекомбінантного пролактину людини в клітинах комах. Умови культивування й інфікування клітин для забезпечення високого рівня експресії рекомбінантного білка. Лабораторна методика одержання пролактину.
Аннотация к работе
Серед продуктів, створених на основі генно-інженерних біотехнологій, найбільшого поширення набули рекомбінантні білки фармацевтичного призначення - білки, які знаходять застосування при лікуванні різноманітних хвороб, виготовленні тест-систем і противірусних вакцин, проведенні наукових досліджень. Одержання вірусних вакцин, отримання гормонів людини з природних джерел (органи та тканини людини, кров, сеча, амніотична рідина) не може забезпечити кількісних показників, прийнятних для потреб медицини або взагалі є неможливим. Проте деякі властивості і останні дані про його функції в організмі свідчать, що цей білок має певний потенціал для використання в лікарській практиці, а отже, вважаються доцільними і дослідження, що стосуються методів його одержання. Дисертаційна робота виконувалась в рамках бюджетних науково-дослідних робіт відділу біохімічної генетики “Дослідження структурно-функціональних взаємодій геному вірусу і клітини в бакуловірусній експресійній системі” (№ державної реєстрації 0196U005246, 1996-2000 рр.) та “Розробка лабораторного регламенту одержання біологічно-активного пролактину людини з використанням бакуловірусної експресійної системи” (№ державної реєстрації 0101U000008, 2001-2003 рр.), де дисертант був виконавцем окремих розділів згідно з планом науково-дослідних робіт. Метою досліджень було вивчення експресії рекомбінантного пролактину людини з використанням бакуловірусної експресійної системи (БЕС) та розробка лабораторного методу одержання і очищення біологічно-активного рекомбінантного пролактину людини.Як клітини-хазяї для рекомбінантних вірусів використовували культури клітин комах Ар (Anteraea pernyi), Sf9, Sf21 (Spodoptera frugiperda), HF (High Five,одержані з Trichopulsia ni) (Gibco BRL), які вирощували на середовищі ТС100 з додаванням 10% ембріональної сироватки теляти (Gibco BRL). Моношарову культуру клітин Ар інфікували рекомбінантним вірусом MANEPRL з множинністю 10 бляшкоутворюючих одиниць (БУО) на клітину. Таким чином, нами одержано ефективну експресію рекомбінантного пролактину людини із застосуванням бакуловірусних систем на основі: ВЯП MANEPRL і моношарової культури клітин Ар та ВЯП ACPRL i моношарових культур клітин HF, Sf9, Sf21. З метою подальшого вдосконалення системи одержання рекомбінантного пролактину необхідно було вирішити такі завдання: Для забезпечення можливості очистки внутрішньоклітинного RPRL за допомогою метал-афінної хроматографії створити рекомбінантний вірус, що експресує RPRL з 6 додатковими залишками гістидину у своєму складі. При аналізі білків із заражених рекомбінантними вірусами ACPRL і ACHISPRL клітин HF в ПААГ і порівняння їх з патерном білків із клітин, інфікованих ВЯП Ас було виявлено суперекспресію білка з молекулярною масою 23-25 КДА, та білка з молекулярною масою 28-30 КДА відповідно (рис 4).В дисертаційній роботі досліджено експресію рекомбінантного пролактину людини в бакуловірусній експресійній системі. Сконструйовано рекомбінантні бакуловіруси MANEPRL, ACPRL, ACHISPRL, ACMELPRL та ACMELPRLHIS, що несуть ген пролактину під промотором гена поліедрину. Одержано ефективну експресію рекомбінантного пролактину людини в культурі клітин Ар (50-70 мг на 1 л поживного середовища), Sf (85-120 мг/л) та HF (175-245 мг/л). Підібрано оптимальні умови для експресії рекомбінантного пролактину людини - культивування в суспензійній культурі та умови інфікування клітин, що забезпечило високий рівень експресії RPRL - близько 500 мг/л внутрішньоклітинного і близько 30 мг/л секретованого. Розроблено методи очищення внутрішньоклітинного RPRL (метал-афінна хроматографія) та секретованого (гепарин-афінна хроматографія), які дозволили одержати високий рівень очистки рекомбінантного білка (95%).