Дослідження основних характеристик об"ємактивованого хлорного струму ICl, swell у епітеліальних клітинах простати LNCaP та вивчення їх модуляції зовнішньоклітинним Са2 , хелаторами Са2 , протонами та трипсином, відновлення клітини гіпотонічним стресом.
Аннотация к работе
Дослідження мембранних провідностей у клітинах простати методами електрофізіології перебувають на початковій стадії і ще не зясовано типи іонних каналів, які вони експресують та роль цих каналів у злоякісному переродженні клітин. Нещодавно в цих самих клітинах було виявлено аніонний канал, активність якого регулюється змінами обєму клітини (ОРАК - обємрегульований аніонний канал, в англійському варіанті - VRAC - volume-regulated anion channel) (Shuba et al., 2000). Враховуючи те, що за даними, отриманими в дослідженнях на інших обєктах, функціонування ОРАК може бути повязане з білками, які посилено експресуються при злоякісному переродженні клітин (Valverde et al., 1992, Gottesman and Pastan, 1993, Wu et al., 1996), а також з причини його ймовірної участі в процесах онкогенезу й трансформації (Chou C.Y.,1995, Nilius B., 1997), надзвичайно актуально зясувати функціональні властивості й роль ОРАК у ракових клітинах простати, а також визначити фактори, що беруть участь у модуляції його роботи. Метою дослідження було визначити основні фізіологічні та біофізичні властивості обємактивованої хлорної провідності в епітеліальних клітинах простати LNCAP, вивчити модулюючу роль низки екзогених факторів на її функції і на підставі цього зробити обгрунтовані висновки щодо структурної організації обємрегульованого хлорного каналу. Усі експериментальні дані, представлені в роботі, отримано вперше: виявлено двофазність змін амплітуди, а також зміни інактиваційних властивостей і обємчутливості ICL,swell у клітинах LNCAP під впливом змін зовнішньоклітинної концентрації протонів; описано ефект внутрішньоклітинних протеаз на ICL,swell і встановлено їхній модифікуючий вплив не тільки на амплітудні та кінетичні характеристики струму, але й на його чутливість до змін клітинного обєму; показано пряму блокуючу дію кальційхелатуючих речовин на обємрегульований хлорний канал.Склад базового зовнішньоклітинного гіпотонічного розчину HYPOTEA був таким (ммоль/л): CACL2 - 2, MGCL2 - 2, Glucose - 10, HEPES - 10, TEACL - 80; в ізотонічному розчині ISOTEA - TEACL - 145; склад гіпотонічного розчину без вмісту двовалентних катіонів (DVC-free HYPOTEA): Glucose - 10, HEPES - 10, TEACL - 80, Ca2 -хелатор - 0-40. Зміна нормального зовнішньоклітинного розчину на розчин із зниженою на 40% тонічністю викликала розвиток додаткового струму, потенціал реверсії якого становив-20±2,4 МВ, що за значенням досить близько до розрахункового рівноважного потенціалу для іонів хлору --17,5 МВ (рис. Наявність у HYPOTEA як підвищеної концентрації Са2 (10 ммоль/л), так і повна його відсутність не викликали ніяких змін ні в часових показниках активації ICL,swell у відповідь на зміну тонічності, ні в амплітуді та кінетиці струму, ні в характеристиках його випрямлення. Крім лінії LNCAP, подібні експерименти на лінії щурячої базофільної лейкемії (RBL-2H3) і кератиноцитах HACAT показали, що ні К -струм в LNCAP, ні Kv1.3-опосередкований К -струм в RBL-2H3 клітинах не були чутливі до зовнішньоклітинної BAPTA. Однак 0,5 ммоль/л BAPTA блокувало ICL,swell в RBL-2H3 клітинах на 49,7±5,3% (n=6) і ICL,swell в HACAT клітинах на 35,7±6,4% (n=4).На клітинній лінії карциноми простати людини за допомогою методу "петч-клемп" у конфігурації "ціла клітина" досліджені основні характеристики (показники розвитку, зменшення та потенціалзалежної інактивації) трансмембранного хлорного струму ICL,swell, що активується у відповідь на осмотично зумовлене збільшення обєму клітини, а також їхня модуляція зовнішньоклітинним кальцієм, кальційхелатуючими речовинами, протонами та внутрішньоклітинно прикладеним трипсином. Встановлено, що зовнішньоклітинний кальцій сам по собі не впливає на характеристики ICL,swell, однак кальційхелатуючі речовини - BAPTA, EDTA і HEDTA - призводять до швидкого, зворотнього, потенціалзалежного блокування струму завдяки прямій взаємодії з обємрегульованими аніонними каналами, що переносять ICL,swell. Висунуто припущення, що ОРАК у клітинах LNCAP мають у своїй структурі як мінімум дві РН-чутливі молекулярні групи з близькими РК~6, титрування яких модулює амплітуду струму, і дві додаткові протончутливі групи, що беруть участь у потенціалзалежній інактивації каналу. Показано, що введення всередину клітини LNCAP протеолітичного ферменту трипсину істотно модифікує роботу ОРАК, спричинюючи значне збільшення чутливості каналів до змін клітинного обєму, збільшення амплітуди ICL,swell і практично повне усунення потенціалзалежної інактивації. Висунуто припущення про наявність двох типів інактивації в ОРАК, і що трипсин впливає на інактивацію N-типу, а протони - на інактивацію С-типу.