Вплив пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 на функціональну активність ефекторів природного імунітету в умовах in vitro, зміни життєздатності пухлинних клітин різного гістогенезу під його впливом. Імунологічні і протипухлинні ефекти вакцини.
Аннотация к работе
Дані літератури [Nitta, 2000; Позур, 2002; Kato, 2007] свідчать, що ПГ та їхні синтетичні аналоги з імуномодуляторними властивостями можуть мати важливе прикладне значення як неспецифічні імуностимулятори, а також використовуватись в якості адювантних компонентів для імунотерапії захворювань людини і тварин, повязаних з функціональними розладами імунної системи. З огляду на те, що на сьогодні залишається актуальним пошук нових протипухлинних препаратів на основі компонентів бактеріальних клітин та зясування їх імуномодуляторної дії, ПГ Staphylococcus aureus Wood 46 може розглядатися як перспективний агент для використання в адювантній терапії. Визначити імуномодуляторні та протипухлинні властивості пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 при його самостійному застосуванні та в якості компонента протипухлинної вакцини. Дослідити вплив різних доз пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 за різних способів його введення на пухлинний ріст та показники імунологічної реактивності мишей з експериментальними пухлинами різного гістогенезу. Методи дослідження: імунологічні - визначення маси і клітинності лімфоїдних органів, оцінка інфільтрації пухлини мононуклеарними лейкоцитами, визначення кисне-залежного метаболізму фагоцитів різних популяцій, визначення цитотоксичної активності природних кілерних клітин, імуноферментний аналіз; методи експериментальної онкології - перещеплення експериментальних пухлин, оцінка показників пухлинного росту: середня тривалість життя тварин, індекс модуляції середньої тривалості життя, розміри первинної пухлини, які оцінювали за середнім її обємом; оцінка життєздатності пухлинних клітин; методи статистичної обробки результатів.Усі дослідження на тваринах здійснювали згідно із нормами, встановленими законом України №3447-IV «Про захист тварин від жорстокого поводження» і норм, прийнятих в Європейській конвенції із захисту хребетних тварин, яких використовують для експериментальних і наукових цілей від 20.09.1985 [Резников, 2001]. Перебіг пухлинного процесу характеризували за стандартними показниками: середня тривалість життя тварин (СТЖ), індекс модуляції середньої тривалості життя (ІМ СТЖ), розміри первинної пухлини на момент проведення досліджень (у мм3), середня кількість метастазів [Куцэнок, 2004]. Вибір в якості обєкта досліджень Staphylococcus aureus Wood 46 мотивований тим, що клітини цього штаму не містять білка А, який застосовується в терапії онкологічних захворювань. Для приготування 1 мл вакцини на основі лектину до 1х107 пухлинних клітин додавали лектин в концентрації 0,06-0,5 мг/мл, інкубували в термостаті при 370С протягом 2-х год, готову вакцину зберігали при-18-20ЄС. Реакцію лімфоїдних органів: регіонарних (по відношенню до місця трансплантації пухлинних клітин і введення ПГ) пахових лімфовузлів, селезінок та тимусів оцінювали за ваговими індексами, які розраховували за формулою: вага органу / загальна вага тварини, а також за відносним вмістом лімфоїдних клітин, який визначали за формулою: абсолютна клітинність/вага органу [Kozlowska, 1997].У результаті виконаної роботи досліджені і визначені імуномодуляторні і протипухлинні властивості пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46, доведено перспективність його використання у протипухлинній терапії як самостійно, так і у складі протипухлинної вакцини. Імуномодуляторні ефекти пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 при пухлинному рості залежать від дози та способу його введення. Пептидоглікан Staphylococcus aureus Wood 46 здійснює стимуляторний вплив як на спонтанний, так і на стимульований кисне-залежний метаболізм фагоцитів різних популяцій, а також на цитотоксичну активність природних кілерних клітин in vitro. Одноразове введення пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 в зону трансплантації клітин експериментальних пухлин в дозі 8 мкг/г гальмувало ріст карциноми легені Льюїс на 25% і помірно інгібувало ріст саркоми S180 на ранніх етапах після перещеплення. Імунізація пептидогліканом Staphylococcus aureus Wood 46 як підшкірно, так і внутрішньочеревно в дозі 8 мкг/г призводила до гальмування росту первинної пухлини у мишей з карциномою легені Льюїс, в середньому, на 25%; метастатичного ураження - на 64%.
План
Основний зміст роботи
Вывод
У результаті виконаної роботи досліджені і визначені імуномодуляторні і протипухлинні властивості пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46, доведено перспективність його використання у протипухлинній терапії як самостійно, так і у складі протипухлинної вакцини.
1. Експериментально доведена ефективність пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 в якості протипухлинного агенту. Імуномодуляторні ефекти пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 при пухлинному рості залежать від дози та способу його введення.
2. Пептидоглікан Staphylococcus aureus Wood 46 здійснює стимуляторний вплив як на спонтанний, так і на стимульований кисне-залежний метаболізм фагоцитів різних популяцій, а також на цитотоксичну активність природних кілерних клітин in vitro.
3. Бактеріальний глікопептид здатний спричиняти загибель пухлинних клітин при сумісному їх культивуванні in vitro. Максимальний відсоток загиблих клітин L-929 спостерігається при їх обробці ПГ у концентраціях 100 і 250 мкг/мл, і перевищує показники спонтанної загибелі в 5,4 і 6,2 рази відповідно. Відносний відсоток мертвих клітин LSK, оброблених пептидогліканом у концентрації 250 мкг/мл, був в 2,5 рази більшим за контрольні проби. Т- і В-клітинні лімфобласти людини виявились практично не чутливими до дії пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46.
4. Одноразове введення пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 в зону трансплантації клітин експериментальних пухлин в дозі 8 мкг/г гальмувало ріст карциноми легені Льюїс на 25% і помірно інгібувало ріст саркоми S180 на ранніх етапах після перещеплення.
5. Імунізація пептидогліканом Staphylococcus aureus Wood 46 як підшкірно, так і внутрішньочеревно в дозі 8 мкг/г призводила до гальмування росту первинної пухлини у мишей з карциномою легені Льюїс, в середньому, на 25%; метастатичного ураження - на 64%.
6. Вакцина з пептидогліканом Staphylococcus aureus Wood 46 ефективніше гальмує пухлинний ріст, ніж сам пептидоглікан. З трьох типів експериментальних пухлин більш результативним виявилось введення вакцини з пептидогліканом тваринам з карциномою легені Льюїс та меланомою В-16, що сприяло зменшенню розмірів первинної пухлини на 46% та 53% відповідно.
7. Реакція органів імунної системи на введення вакцини з пептидогліканом Staphylococcus aureus Wood 46 у тварин з різними моделями пухлинного росту відрізняється: у тварин з карциномою легені Льюїс спостерігалось збільшення вагових індексів і клітинності тимусів, що вказує на більш виразну активацію клітинного імунітету. У мишей з меланомою В-16 відмічено достовірне підвищення значень показників ваги і клітинності як для тимусу, так і для селезінки, що свідчить про активацію як клітинних, так і гуморальних імунних реакцій.
8. Імунізація протипухлинною вакциною з пептидогліканом сприяє відновленню кисне-залежного метаболізму перитонеальних макрофагів до рівня інтактних тварин у мишей з меланомою В-16 і не впливає достовірно на метаболізм фагоцитів у мишей з карциномою легені Льюїс.
9. Використання протипухлинної вакцини з пептидогліканом супроводжується появою в сироватці крові антитіл проти пептидоглікану, що свідчить про формування гуморального імунітету проти стафілококової інфекції паралельно з активацією протипухлинних імунних реакцій.
Список литературы
1. Вплив стафілококового пептидоглікану на ріст і метастазування карциноми легені Льюїс у мишей / Л.М. Сківка, В.В. Позур, Т.М. Фурзікова [та ін.] // Доповіді Національної академії наук України - 2006. - №5. - С. 155-157. (Дисертантом особисто проведено імунізацію тварин стафілококовим пептидогліканом, дослідження впливу пептидоглікану на ріст і метастазування експериментальної пухлини, здійснено аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, роботу до друку підготовлено колективно).
2. Позур В.В. Пептидоглікан Staphylococcus aureus та його імунобіологічні властивості / В.В. Позур, Л.М Сківка, Г.П. Потебня // Біополімери і клітина - 2008. - №1. - том 24. - С. 3-14. (Дисертантом особисто підібрано і проаналізовано наукову літературу стосовно імунобіологічних властивостей пептидогліканів та перспективи їх застосування в якості адювантів в імунотерапії злоякісних новоутворень, підготовлено роботу до друку).
3. Позур В.В. Вплив протипухлинної вакцини на основі пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 на ріст меланоми В-16 / В.В. Позур, Л.М Сківка, Г.П. Потебня // Імунологія та алергологія - 2008. - №3. - С. 8-10. (Дисертантом особисто проведено планування схеми експерименту, виготовлення протипухлинної вакцини з пептидогліканом, імунізацію тварин вакциною, дослідження її впливу на ріст меланоми В-16 у мишей, здійснено аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, підготовлено роботу до друку).
4. Позур В.В. Вплив пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 на кисне-залежний метаболізм макрофагів і нейтрофілів / В.В. Позур, Л.М Сківка, Г.П. Потебня // Доповіді Національної академії наук України - 2008. - №3. - С. 156-158. (Дисертантом особисто проведено планування схеми експерименту, дослідження впливу пептидоглікану на кисне-залежний метаболізм макрофагів і нейтрофілів в НСТ-тесті, здійснено аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, роботу до друку підготовлено колективно).
5. Позур В.В. Вплив аутовакцини на основі пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 на динаміку росту експериментальних пухлин у мишей / В.В. Позур, Л.М Сківка, Г.П. Потебня // Доповіді Національної академії наук України - 2008. - №12. - С. 145-149. (Дисертантом особисто проведено планування схеми експерименту, виготовлення протипухлинної вакцини з пептидогліканом, імунізацію тварин вакциною, дослідження її впливу на ріст експериментальних пухлин різного гістогенезу у мишей, здійснено аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, підготовлено роботу до друку).
6. Позур В.В. Реакція лімфоїдних органів мишей на пептидоглікан Staphylococcus aureus Wood 46 в нормі і при пухлинному рості / В.В. Позур, Л.М Сківка, Г.П. Потебня // Мікробіологія і біотехнологія - 2008. - №3. - С. 69-74. (Дисертантом особисто проведено планування схеми експерименту, імунізацію тварин пептидогліканом, визначення маси та клітинності лімфоїдних органів, аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, роботу до друку підготовлено колективно).
7. Патент на корисну модель А61К35/12, №31924. Україна. «Спосіб отримання протипухлинної аутовакцини» / Сківка ЛМ, Позур ВВ, Потебня ГП, Черемшенко НЛ, Позур ВК (Україна); №2007 14465; Заявл. 21.12.2007; Опубл. 25.04.2008: Бюл. №8. (Дисертантом особисто проведено виготовлення протипухлинної вакцини з пептидогліканом, аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, матеріал до патентування підготовлено колективно).
8. Skivka L. The effect of peptidoglycan from Staphylococcus aureus on cytotoxic activity of murine mononuclear splenocytes / L Skivka, A Fedorchuk, O Pyaskovskaya, N Khranovska, V Pozur // 5th meeting of the European mucosal immunology group (Prague, Czech republic) 5-7 october 2006. - Cz., 2006. - Р. 63.
9. Позур В.В. Вплив стафілококового пептидоглікану на метаболічну активність фагоцитів різних популяцій / В.В. Позур, Л.М. Сківка, Г.П. Потебня // VI Всеукраїнська конференція студентів та аспірантів «Дослідження молодих вчених на Україні» 20-21 вересня 2007 р. - К., 2007. - С. 42-43.
10. Позур В.В., Порівняльна характеристика впливу різних доз пептидоглікану S. aureus на ріст експериментальних пухлин у мишей / В.В. Позур, М.П. Рудик, Л.М. Сківка, В.К. Позур // V міжнародна науково-практична конференція «Становление современной науки - 2007» 1-15 жовтня 2007 р. - Д., 2007. - С. 42-44.
11. Позур В.В., Л.М. Сківка, Г.П. Потебня Динаміка росту експериментальних пухлин у мишей під впливом аутовакцини з пептидогліканом / В.В. Позур, Л.М. Сківка, Г.П. Потебня // IV Міжнародна наукова конференція «Молодь та поступ біології» 7-10 квітня 2008 р. - Л., 2008. - С. 332.
12. Позур В.В. Порівняльна характеристика різних способів введення протипухлинної аутовакцини на основі пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 у мишей з меланомою В-16 / В.В. Позур, Л.М. Сківка, Г.П. Потебня // VI Міжнародна науково-практична конференція студентів, аспірантів та молодих вчених «Шевченківська весна» 20-23 березня 2008 р. - К., 2008. - С. 87-88.
13. Позур В.В. Вплив пептидоглікану Staphylococcus aureus Wood 46 та протипухлинної аутовакцини виготовленої на його основі на динаміку росту карциноми легені Льюїс у мишей / В.В. Позур, Л.М. Сківка, Г.П. Потебня // ІХ Міжнародна конференція молодих онкологів «Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології» 23-24 квітня 2008 р. - К., 2008.-С. 89.