Оптимальний режим виділення із клітин піднебінних мигдаликів діалізабельних чинників. Біохімічна характеристика отриманих діалізатів. Дослідження по визначенню імуномодулюючих властивостей діалізатів із клітин піднебінних мигдаликів, аналіз результатів.
Аннотация к работе
Незаперечні докази участі тонзил в реакціях імунітету, представлені за останні 20 років, сприяли більш стриманому підходу до оперативного лікуваня хронічного тонзиліту і розробці методів консервативної терапії цього захворювання, що базуються на принципах локальної та системної імуномодуляції (Б.С.Преображенский, Г.Н.Попова, 1970; Э.В.Гюллинг, О.Ф.Мельников, 1976; А.Е.Вершигора, 1978; В.Н.Горбачевский, 1980; А.И.Цыганов и соавт., 1980; О.Ф.Мельников, 1981; В.А.Попа, 1984; О.Г.Рыльская, 1990; А.В.Чернишов, 1991; Д.И.Тарасов, Б.К.Сагалович, 1995; В.В.Кіщук, 1996; Д.І.Заболотний, 1997; В.Ф.Філатов та співавт., 1997; В.М.Фролов та співавт., 1997; О.В.Дюмін, 1998; Surian, 1997; Okada et. al. Вивчення цитокінового спектру піднебінних мигдаликів при хронічному тонзиліті показало, що в них має місце дефіцит ряду факторів, необхідних для формування повноцінної імунної відповіді (Murakata et. Це підтверджується отриманими раніш даними про розвиток в мигдаликах при хронічному тонзиліті локальної імунологічної недостатності (О.Ф.Мельников, 1981; В.Д.Яковенко, 1985). Таким чином, виділення із піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт імуноактивних субстанцій дозволить розшифрувати механізми захисної функції тонзил, варіанти їх порушення, а також отримати імуноактивні фактори, які можуть бути потенційними лікувальними засобами нового покоління. Враховуючи викладене, метою роботи було виділення, біохімічна та імунологічна характеристика імуноактивних діалізабельних чинників із клітин піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт.
Список литературы
По темі дисертації опубліковано 4 журнальні статті, 2 - в збірках наукових праць.
Структура дисертації.
Дисертація викладена на 118 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, чотирьох розділів власних досліджень, заключення, висновків, практичних рекомендацій, списку використаної літератури, який налічує 155 джерел, з них 79 - іноземних авторів. Роботу ілюстровано 23 таблицями та 6 рисунками.
Зміст роботи імуномоделюючий мигдалик діалізат
Матеріали та методи досліджень
Матеріалом для досліджень служили піднебінні мигдалики та периферична кров хворих на хронічний тонзиліт, периферична кров практично здорових осіб, лімфоїдні органи і периферична кров мишей ліній СВА; C57Bl/6, нелінійних мишей та щурів лінії Wistar. Крім того, матеріалом для досліджень були культури клітин різного гістогенезу: L-41, пухлинні лінії (К-562; Нер-2), фібробласти (L-929), лімфоцити алогенних мигдаликів та периферичної крові хворих раком гортані і пацієнтів із запальними процесами верхніх дихальних шляхів, еритроцити людини групи АВ.
Матеріал для досліджень отриманий від 66 хворих, в тому числі на хронічний тонзиліт (32); рак гортані (20); лімфосаркому верхніх дихальних шляхів (14), а також від 10 практично здорових осіб. Окрім того, в роботі використано 348 мишей ліній СВА, C57Bl/6, білих нелінійних мишей та 46 щурів Wistar.
Для одержання та дослідження імуноактивних субстанцій в діалізабельних фракціях тканинних лімфоцитів використані клітини піднебінних мигдаликів, а також досліджувалась периферична кров хворих на хронічний тонзиліт, котрим за показаннями була проведена тонзилектомія. Донорами лімфоцитів периферичної крові були також практично здорові особи, що проходили імунологічне обстеження в лабораторії патофізіології та імунології Київського НДІ отоларингології. Донори піднебінних мигдаликів представлені хворими з діагнозом: хронічний тонзиліт, декомпенсована форма, рецидиви ангін (И.Б.Солдатов, 1975). В роботі використані піднебінні мигдалики 20 чоловіків та 12 жінок віком від 16 до 40 років із давністю захворювання не менше 3 років.
При дослідженні імуноактивних властивостей діалізабельних фракцій із лімфоцитів мигдаликів і периферичної крові використовували клітини крові хворих на рак гортані, як правило, II-III стадії другої клінічної групи, які мали відхилення в стані імунної системи на момент обстеження, а також хворих на лімфосаркому верхніх дихальних шляхів.
Експериментальні дослідження виконані на нелінійних мишах, мишах ліній СВА, C57Bl/6, BALB/c та щурах Wistar. Крім того, частина експериментів виконана на культурах клітин, таких як L-929, L-41 (ІМБГ НАН України), Hep-2 і K-562 (УНЦРМ). Штам клітин карциноми Льюїс отриманий із ІЕПОР НАН України. Тварини утримувалися в умовах віварію КНДІ отоларингології. Робота з ними проводилася у відповідності з правилами поводження із експериментальними тваринами.
В експериментах in vitro використовувались також короткотермінові культури алогенних тонзилоцитів, ксеногенних (еритроцити курей) і алогенних еритроцитів, на яких перевірялась цитотоксична дія одержаних діалізабельних фракцій. Культури готували в день постановки експерименту.
Методи біохімічного розділення та аналізу
Отримання фракцій розчинних діалізабельних факторів із лімфоцитів піднебінних мигдаликів хворих на декомпенсовану форму хронічного тонзиліту і периферичної крові людей здійснювали у відповідності з рекомендаціями Шрьодера, Лоренца (1979), з нашими модифікаціями, описаними у розділі власних досліджень. Визначення загального вмісту білку в діалізатах проводили за методом Лоурі (1951). Сумарну протеолітичну активність виявляли за методом К.М.Веремєєнко і спіавторів (1988). Для виявлення трипсиноподібної активності використовували хромогенний субстрат N-бензоїл-ДL-аргинін-п-нітроанілід-БАПНА (К.М.Веремєєнко, 1971). Активність трипсиноподібного ферменту калікреїну досліджували за допомогою специфічного хромогенного субстрату - хромозиму РК (Helmark, Davie, 1984). Рівень кінінруйнуючого ферменту кінінази визначали за швидкістю розщеплення субстрату гіпурил-L-лізину (Folk et. al., 1960). Загальну антитриптичну активність досліджували за методом К.М.Веремєєнко і співавторів (1988).
Розділення білків діалізабельної фракції проводили методом диск-електрофорезу, використовуючи 15% поліакріламідний гель із додецилсульфатом натрію (Tuemml, 1970).
Імунологічні методи
Присутність цитокінів у діалізатах із зруйнованих клітин піднебінних мигдаликів і супернатантах, отриманих після культивування клітин периферичної крові із діалізатами і без них, визначали за активністю, властивою окремим цитокінам.
Наявність в досліджених препаратах фактора некрозу пухлин досліджували в культуральному тесті за рівнем деструкції клітин лінії L-929, попередньо оброблених актиноміцином-D (Serva), використовуючи фотометричний тест із кристалічним фіолетовим.
Оптичну густину вимірювали при довжині хвилі 540 нм. В основі данної методики лежать рекомендації Н.С.Дяченко і співавторів, (1994).
Активність фактору гальмування міграції (ФГМ) клітин крові виявляли використовуючи капілярний тест з планіметричною оцінкою рівня гальмування. В якості мігруючих клітин використовували лейкоцити крові здорових донорів, які виділяли методом спонтанного осаджування по оригінальній методиці (О.Ф.Мельников та співавт., 1985). При виконанні данної частини роботи використовували непрямий метод оцінки гальмування міграції клітин у відповідності із рекомендаціями О.Ф. Мельникова (1974).
Наявність в діалізатах фактору переносу визначали за здатністю препарату переносити гіперчутливість сповільненої дії до антигену стрептокока-Ст-О у інтактних мишей лінії СВА. Оцінку розвитку ГСД проводили по зміні маси підколінних лімфатичних вузлів згідно рекомендацій Е.В.Гюллінга, М.Б.Самбур (1981).
Активність колонієстимулюючого фактору виявляли в діалізаті клітин мигдаликів по рівню і якісній характеристиці ендогенних колоній у сублетально опромінених мишей лінії СВА (Till, MCCULLOCH, 1961).
Інтерферон визначали по антивірусній активності препаратів - їх здатності захищати клітини від зараження вірусом хвороби везикулярного стоматиту (ВВС). Використовували методику 50% противірусної захисної дії (ЦПД-50) у відповідності з рекомендаціями Н.С.Дяченко та співавторів (1994).
При дослідженні впливу діалізатів на активність природніх цитотоксичних клітин (ПЦК) практично здорових осіб і хворих на рак гортані використовували рекомендації О.Ф.Мельникова і співавторів, (1985). Застосовували два типи мішеней: клітини еритролейкозу людини К-562 та еритроцити курчат. Оцінку реакції проводили радіометрично на установці Гамма-12 (Україна), використовуючи в якості ізотопного маркера Cr51 (Amersham, Великобританія). Ефектори виділяли з периферичної крові шляхом розділення на градієнті щільності феколл-верографіну.
Рівень модуляції гуморального імунітету досліджували в експериментах in vivo на мишах лінії СВА. Вивчали реакції системи імунітету при введенні діалізатів, антигенів різного типу: стрептолізину-О, еритроцитів барана (ЕБ). При введенні стрептолізину-О сумарну продукцію антитіл оцінювали за допомогою реакції нейтралізації, при введенні еритроцитів барана - за реакцією гемаглютинації із застосуванням мікротитратора Такачі (О.Ф.Мельников, 1981).
При вивченні цитотоксичної дії діалізатів із клітин піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт та із клітин крові, використовували радіометричний метод оцінки ступеню деструкції мішеней із застосуванням Cr51 в вигляді ізотопного маркера. Крім цього, при використанні інших мішеней, наприклад клітин раку гортані людини Нер-2, застосовували вітальні барвники з наступною спектрофотометрією. Досліджували цитотоксичну дію діалізатів різного походження та супернатантів після дії ними на алогенні лімфоцити мигдаликів і ксеногенні еритроцити. Як правило, випробовували дози діалізатів по 2,20 та 200 мкг по білку, а супернатантів - 0,2 мл на 2 млн мішеней в обємі 1 мл середовища RPMI-1640 (Serva). Час культивування - 16 годин при температурі 37 ОС.
Кількість лейкоцитів і іх розподіл за окремими формами досліджувались в мазках крові експериментальних тварин загальноприйнятим методом із використанням фарбування за Паппенгеймом. При цьому особливу увагу звертали на вміст великих грануловмісних лімфоцитів, які є носіями природньої клітинної цитотоксичності (К.П.Зак, З.А.Бутенко, 1988; І.Кохан, 1994).
Допоміжні методи
При дослідженні впливу діалізабельного фактора на розвиток експериментального пухлинного процесу у мишей лінії C57Bl/6, кожній із 38 мишей у ділянці стегна внутрішньомязево вводили 3х103 клітин карциноми Льюїс. Через 6 діб тварин розділили на 2 групи (20 тварин в експериментальній групі і 18 - в контрольній). Тваринам експериментальної групи на протязі 2-х тижнів вводили 0,1 мл ДФ (2 мкг препарату по білку), отриманого з мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт. Тваринам контрольної групи на протязі двох тижнів вводили по 0,1 мл фізіологічного розчину.
Статистичні методи
При побудові багатофакторних експериментів використовували рекомендації А.І.Лисенкова (1979). Результати досліджень оброблені статистично з використанням параметричних та непараметричних критеріїв (Е.В.Гублер, 1978). При статистичній обробці результатів титрування визначали величину середнього геометричного титра і його похибки за методом В.И.Левинсона (1968).
Результати дослідження та їх обговорення
Для виділення із піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт імуноактивних речовин було використано модифікований метод Шрьодера-Лоренца. Діалізабельний фактор мигдаликів отримували із лімфоцитів тонзил шляхом їх механічної гомогенізації, серії циклів заморожування і відтавання з наступною обробкою ДНК-азою, активованою іонами магнію, та діалізом крізь целофанову мембрану протягом 16 годин. Установлено, що ДФМ є пептидно-білковою сумішшю із молекулярною масою < 25 КД, володіє активністю деяких протеолітичних ензимів. При електрофоретичному дослідженні білки ДФМ розподілялись переважно в зоні міграції a- та b-глобулінів. Подібна технологія отримання імуноактивних речовин, значним чином відрізняється від методик інших авторів (Е.В.Лукач, 1975; В.Х.Хавінсон та співавт., 1982; Schroder et. al., 1978).
Імуномодулюючі властивості діалізату проявились у його здатності переносити ГСД до Ст-О від людини до мишей, що може свідчити про наявність в ДФМ активності, подібної до фактору переноса.
Новим імуномодулюючим ефектом, відмінним від раніше описаних, є здатність ДФМ посилювати імунну реакцію на антигени стрептококу при формуванні гуморальної відповіді на Ст-О, коли замість передуючої дози антигену вводили ДФМ. Гуморальна відповідь при наступній імунізації Ст-О суттєво перевищувала рівень реакції, коли примуючою була інєкція вказаного антигену стрептококу.
Феномен підсилення не повязаний з наявністю в ДФМ залишкових кількостей Ст-О, оскільки в дослідженнях радіометричним методом не виявлено ертитроцитолітичної здатності ДФМ по відношенню до червоних кровяних тілець людини.
При проведенні подальших досліджень по імунологічній характеристиці ДФМ, була виявлена його здатність посилювати in vitro експресію СД-2 рецепторів на Т-лімфоцитах, що зближує його з препаратами, отриманими іншим шляхом із вилочкової залози та тонзил.
Важливим моментом, на наш погляд, є виявлення в ДФМ речовин, здатних посилювати диференціювання стовбурових поліпотентних клітин кісткового мозку, про що свідчать експерименти на опромінених мишах, у яких при введенні ДФМ збільшувалась кількість саме лімфоїдних елементів в колоніях селезінки (табл.1).
Таблиця 1. Склад клітинних колоній селезінки мишей дослідної і контрольної груп, які отримали сублетальну дозу g-опромінення
Тип клітин Склад клітин,%
Дослід Контроль
Лімфоцити 40,0 10,0
Мієлоцити-мієлобласти 30,0 70,0
Лейкоцити (паличкоядерні та сегментоядерні) 2,0 10,0
Інші клітини 28,0 10,0
Фактор некрозу пухлини був виявлений не у всіх зразках діалізатів, так само, як і інтерферон, для продукції якого необхідна присутність інтерфероніндукуючого ліганду. В значній мірі це відноситься і до визначення в ДФМ фактору гальмування міграції лейкоцитів.
При вивченні цитотоксичних властивостей ДФМ по відношенню до алогенних клітин піднебінних мигдаликів, аденоїдів та ксеногенних еритроцитів (ЕК) було виявлено, що клітинні популяції лімфоглоточного кільця не руйнувались під впливом ДФМ, тоді як ксеногенні еритроцити піддавались лізису при 16-годинному контакті з ДФМ. З такою ж приблизно інтенсивністю руйнувались in vitro в присутності ДФМ пухлинні алогенні клітини-мішені карциноми гортані Hep-2 та еритролейкозу людини К-56.
Обробка ДФМ лімфоцитів крові онкологічних хворих та практично здорових донорів супроводжувалась появою в супернатантах цитотоксичних факторів по відношенню до пухлинних клітин, які за рівнем своєї протипухлинної активності суттєво перевищували активність власне ДФМ.
Одним із важливих механізмів протипухлинної резистентності є функціональний стан системи природніх цитотоксичних клітин. Тому цікаво було дослідити вплив ДФМ на їх активність, а також на вміст в крові їх морфологічного носія - великих гранулярних лімфоцитів (ВГЛ).
Встановлено, що вплив ДФМ на активність ПЦК був різноспрямованим і багато в чому залежав від вихідного рівня їх активності. При статистичній обробці матеріалу встановлено, що у хворих лімфосаркомою верхніх дихальних шляхів ПЦК крові активувались або пригнічувались в рівній мірі, хоча при інтегральному підході вектор змін був спрямований в бік стимуляції активності ПЦК. У хворих на рак гортані таких флюктуацій у напрямку модулюючої дії ДФМ не виявлено. Встановлено високу стимулюючу активність ДФМ по відношенню до природніх цитотоксичних клітин цієї категорії хворих (табл.2).
Таблиця 2. Вплив ДФМ на активність ПЦК крові хворих на рак гортані
Показники Вихід ізотопа Cr51 з мішеней,%
Вихідний рівень активності ПЦК Рівень активності ПЦК при додаванні ДФМ
М 13,8 29,2*
МК 0 - 36 7,5 - 72 n 8 8
Аналізуючи дані про вплив ДФМ на продукцію цитокінів, насамперед ФНП, лімфоцитами онкологічних хворих, пряму цитотоксичну дію ДФМ на ряд гістогенетично відмінних пухлин in vitro та здатність діалізабельних чинників із лімфоцитів тонзил активізувати систему ПЦК онкологічних хворих, доцільно вважати, що піднебінні мигдалики містять ряд біологічно активних речовин, які здатні активно модулювати механізми протипухлинної резистентності організму людини. З врахуванням цих даних ДФМ можна розглядати як імуноактивний біопрепарат для застосування в онкологічній практиці.
При введенні ДФМ мишам з карциномою Льюїс було виявлено, що в експериментальній групі тварин, які отримували ДФМ, пухлини зявилися на тиждень пізніше, ніж в контрольній групі.
Дослідження морфологічного складу крові виявило достовірне збільшення кількості великих грануловмісних лімфоцитів в крові мишей, яким вводили ДФМ. Цей факт підтверджує раніш отримані дані про суттєву протипухлинну спрямованість дії речовин, які містяться в ДФМ.
Таким чином, проведені дослідження по виділенню із піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт імуноактивних пептидно-білкових субстанцій свідчать, що, цілком ймовірно, ці лімфоїдні утворення містять широкий спектр ферментів і цитокінів, які і визначають спрямованість дії ДФМ. Із приведеного діапазону імуномодулюючих ефектів чітко витікає можливість проведення коригуючої терапії імунодефіцитних станів, в першу чергу у онкологічних хворих.
Факт низької активності ДФМ із мигдаликів деяких хворих на хронічний тонзиліт може свідчити або про втрату їх клітинами імунологічних функцій в результаті численних запалень і заміщення сполучною тканиною активної паренхіми, або про функціональну блокаду клітин-продуцентів імуноактивних молекул чи рецепторних структур (Berstein et. al., 1994; Murakata et. al., 1996).
Одним із важливих моментів, що витікають із результатів даного дослідження, є той факт, що навіть в умовах хронічного, як правило, продуктивного запалення піднебінні мигдалики людини продовжують залишатися важливим імунологічно активним органом. Виключення його із взаємоповязаної мережі органів системи імунітету хоча і не призводить до значного послаблення імунного статусу організму, та все ж, при певних обставинах, можне негативно відбитися на механізмах захисту та адаптації. В звязку з цим розробка нових ефективних методів діагностики та лікування хронічного тонзиліту продовжує залишатися актуальним завданням сучасної отоларингології.
Розроблена технологія лабораторного отримання діалізабельного фактору із лімфоцитів піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт може служити основою для досліджень по створенню лікувальних засобів нового покоління.
Висновки
1. Із клітин піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт можна виділити імуноактивні речовини пептидно-білкової природи, які активно модулюють реакції системи імунітету і посилюють дію факторів неспецифічної резистентності.
2. Діалізабельні фактори із піднебінних мигдаликів є пептидно-білковими субстанціями з молекулярною масою до 25 КД, які мають певну протеолітичну активність, обумовлену наявністю низькомолекулярних ферментів.
3. ДФМ здатен переносити сповільнену гіперчутливість до антигена стрептококку, а також суттєво стимулювати рівень вторинної гуморальної відповіді на стрептолізин-О.
4. ДФМ притаманні властивості трансфер-фактора, фактора некрозу пухлин, фактора гальмування міграції клітин, колонієстимулюючого фактора, а також активність, що сприяє збільшенню числа Т-лімфоцитів, які експресують CD-2 рецептори.
5. В умовах експерименту виявлена здатність ДФМ змінювати напрям диференціювання стовбурових поліпотентних клітин кісткового мозку опромінених мишей в бік клітин лімфоїдного ряду. У тварин-пухлиноносіїв введення ДФМ призводило до збільшення вмісту в крові великих гранулярних лімфоцитів.
6. ДФМ, за умов тестування in vitro, не має цитотоксичної дії по відношенню до алогенних еритроцитів крові і лімфоцитів піднебінних мигдаликів, однак здатен викликати лізис пухлинних клітин типу Hep-2 i K-562, а також ксеногенних еритроцитів, які містять ядро. Обробка діалізабельним фактором лімфоцитів крові людини супроводжується появою в супернатантах цитотоксичних субстанцій, які за своєю літичною здатністю по відношенню до пухлинних клітин перевищують сам ДФМ.
7. ДФМ стимулює протипухлинну резистентність, підвищує активність природніх кілерних клітин крові у хворих із злоякісними пухлинами верхніх дихальних шляхів, затримує розвиток пухлинного процесу у мишей з перещепленою карциномою Льюїс.
Практичні рекомендації
1. Враховуючи, що піднебінні мигдалики містять імуноактивні субстанції, здатні активізувати механізми антибактеріальної, антивірусної, протипухлинної резистентності є доцільним дотримуватися більш диференційованого підходу до оперативного лікування хронічного тонзиліту.
2. Рекомендовано застосування діалізабельних факторів, після відповідної обробки та тестування, для лікування хронічних інфекцій та імунодефіцитних станів, в тому числі зумовлених пухлинним процесом.
Список праць, опублікованих за темою дисертації
1. Вплив діалізату з клітин піднебінних мигдаликів у хворих на хронічний тонзиліт на вторинну імунну відповідь до стрептолізину-О // Журн.ушных, носовых и горловых болезней. - 1997. - № 2 - С.46-49 / Співавт.: Мельников О.Ф., Заболотний Д.І., Веремєєнко К.М.
2.Влияние диализабельных факторов из лимфоцитов небных миндалин у больных хроническим тонзиллитом на развитие опухолевого процесса в эксперименте // Журн.ушных, носовых и горловых болезней. - 1997. - № 3. - С.84-85 / Співавт.: Мельников О.Ф., Заболотный Д.И., Веремеенко К.М., Тимченко С.В.
3. Иммуноактивные пептиды в небных миндалинах больных хроническим тонзиллитом и их роль в защитных реакциях // Журн.ушных, носовых и горловых болезней. - 1997. - № 5. - С.88-93. / Співавт.: Мельников О.Ф.
4. Получение и иммуномодулирующие свойства низкомолекулярного диализата из клеток небных миндалин больных хроническим тонзиллитом // Тез. докл. VI съезда отоларингологов Беларуси. - Витебск. - 1996. - С.45 / Співавт.: Мельников О.Ф., Веремеенко К.М., Заболотный Д.И., Кизим А.И., Самбур М.Б.
5. Біологічна активність діалізабельної фракції тонзилоцитів людини // Физиол. журнал. - 1996. - Т.42. - №3-4. - С.50-51 / Співавт.: Мельников О.Ф., Кізім О.Й., Самбур М.Д., Тимченко С.В., Калиновська Л.П., Заєць Т.А 6. Одержання та дослідження впливу діалізабельної фракції з лімфоцитів мигдаликів людини на механізми протипухлинної резистентності в умовах in vitro // Сучасні проблеми отоларингології - Київ, 1998. - С.77-83 / Співавт.: Мельников О.Ф., Веремієнко К.М., Самбур М.Д., Тимченко С.В., Голобородько О.П., Карпенко Г.Ф., Заєць Т.А., Кривохатська Л.Д., Тимченко М.Д.