Закономерности формирования эпидермального пласта из кератиноцитов человека и возможность реконструкции структурно-функциональных единиц. Эпителио-мезенхимные взаимодействия и эпидермальный морфогенез. Пролиферативная активность мигрирующих клеток.
Аннотация к работе
Суспензию кератиноцитов вносили в культуральные сосуды в смеси сред ДМЕМ:F12 (1:1) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) с добавлением инсулина (5 мкг/мл, Sigma), изопротеренола (10-6М, Sigma), эпидермального фактора роста (10 нг/мл, Sigma). Клетки инкубировали при 370С в атмосфере воздуха, содержащем 3 % СО2 и насыщающей влажности. На коллагеновый гель суспензию высаживали в концентрациях 300 тыс/мл и 1млн/мл. Клетки культивировали в среде Игла или ДМЕМ с 10% ЭТС.3.1 Формирование многослойного эпидермального пласта в культуре. Изолированные кератиноциты, при культивировании образуют агрегаты. В составе прикрепившихся агрегатов распластывание кератиноцитов усиливается, причем можно выделить плотно упакованные, компактизованные клетки в центре агрегата и хорошо распластанные клетки на его периферии. Среди распластанных клеток обнаруживаются клетки, экспрессирующие белок Ki67 (Рис. 1а), ассоциированный с пролиферацией. Первичная колония кератиноцитов человека. Иммуногистохимия. Доля Ki67-положительных клеток в первые 8 часов культивирования не превышает 30%. В культуре обнаруживаются кератиноциты, экспрессирующие транскрипционный фактор р63 - мастер-ген эпидермальной дифференцировки и маркер столовых/прогениторных клеток (Рис. 2а, б), т.е. кератиноциты с фенотипом клеток базального слоя с высоким пролиферативным потенциалом. Иммунофлуоресценция. Исследование пролиферативной активности в многоклеточных кластерах первичных эпидермальных кератиноцитов, а также иммортализованных и трансформированных клеток, показало, что различия в числе пролиферирующих клеток в разных частях колонии мало влияют на выбор кластером клеток направления движения, однако, обработанные митомицином С неделящиеся клетки никогда не оказываются в первом ряду ведущего края колонии. При добавлении в среду культивирования эпидермального фактора роста (EGF) наблюдали значительную стимуляцию миграции (Рис. В качестве матрикса для культивирования мы использовали коллагеновый гель, что позволяет изучать взаимодействие клеток с матриксом, регуляцию пролиферации и дифференциации клеток, а также создает возможность выявить факторы, способствующие росту и миграции эпидермальных кератиноцитов.