Дослідження кінетики реакції гідролізу казеїну вільними протеолітичними ферментами різного походження. Розробка очних лікарських плівок з іммобілізованими папаїном і сечовиною. Субстратне інгібування активності папаїну, трипсину і лужної протеази.
Аннотация к работе
Фундаментальні дослідження в області біотехнології дозволяють отримувати нові перспективні препарати на основі іммобілізованих гідролітичних ферментів і білків. Іммобілізація біологічно-активних речовин (БАР) на полімерних носіях приводить до створення стабільних активних препаратів пролонгованої дії з контрольованим вивільненням, направленим вектором всмоктування для використання в різних областях медицини, у тому числі для терапії ран і опіків [Романовська І.І., 2009]. Переваги іммобілізованих форм ферментів і білків над вільними відомі, найбільш суттєві з них - стабілізація, зниження імунологічних і алергічних реакцій організму за рахунок послаблення здатності стимулювати утворення антитіл і реагувати з ними. У звязку з цим проблема розробки полімерних плівкових форм іммобілізованих білків, ферментів з використанням нових або недостатньо вивчених полімерних носіїв є актуальною, представляючи не лише практичний, але і теоретичний інтерес, доповнюючи знання про властивості матриць, продукти і характер взаємодії БАР-матриця, фізико-хімічні і медико-біологічні особливості їх функціонування як потенційних лікарських засобів. Відповідно до поставленої мети основними завданнями роботи були наступні: 1. розробка способів іммобілізації в полівініловий спирт (ПВС) білків (сироватковий альбумін людини (САЛ), бичачий сироватковий альбумін (БСА), овальбумін (ОА)), що дозволяють отримувати стабільні препарати у формі плівок пролонгованої дії;Зміна значень вязкості розчинів носія і білків, вивчення комплексоутворення свідчать про наявність асоціатів білок: носій при мольних відношеннях БСА: ПВС, ОА: ПВС, САЛ: ПВС відповідно 1: 2,5; 1: 3,1; 1: 4; їх зменшення призводить до механічного включення білків в полімер. Показано, що ОЛП з САЛ при концентрації білка в 100 разів нижче за таку в розчині, мають високу поглинаючу здатність до кислот і лугів, що перспективно для сорбційної терапії опіків очей. Дослідження кінетики гідролізу казеїну протеазами рослинного, тваринного і мікробного походження показало істотне (50 %-ве) субстратне інгібування протеолітичної активності папаїну, трипсину і лужної протеази, що дозволяє рекомендувати для точнішого визначення казеїнолітічної активності використання 0,35 - 0,9 % розчину субстрату. Розроблені умови сумісної іммобілізації папаїну і сечовини в ПВС, що сприяють отриманню ОЛП зі збільшеною в 1,2 рази протеолітичною активністю (389 од/г), пролонгованої дії, стабільністю при г-стерилізації і зберіганні протягом 1 року.
Вывод
На основі теоретичних і експериментальних досліджень розроблені методи іммобілізації білків, папаїну і інших протеолітичних ферментів на полімерних носіях природного і синтетичного походження, вивчені фізико-хімічні особливості функціонування отриманих препаратів, перспективних для терапії ран і опіків.
1. Шляхом іммобілізації альбумінів в ПВС отримані їх плівкові форми пролонгованої дії з кількісним ступенем включення, стабільні при зберіганні (8 міс. - 1 рік). Зміна значень вязкості розчинів носія і білків, вивчення комплексоутворення свідчать про наявність асоціатів білок: носій при мольних відношеннях БСА: ПВС, ОА: ПВС, САЛ: ПВС відповідно 1: 2,5; 1: 3,1; 1: 4; їх зменшення призводить до механічного включення білків в полімер. Показано, що ОЛП з САЛ при концентрації білка в 100 разів нижче за таку в розчині, мають високу поглинаючу здатність до кислот і лугів, що перспективно для сорбційної терапії опіків очей.
2. Дослідження кінетики гідролізу казеїну протеазами рослинного, тваринного і мікробного походження показало істотне (50 %-ве) субстратне інгібування протеолітичної активності папаїну, трипсину і лужної протеази, що дозволяє рекомендувати для точнішого визначення казеїнолітічної активності використання 0,35 - 0,9 % розчину субстрату.
3. Розроблені умови сумісної іммобілізації папаїну і сечовини в ПВС, що сприяють отриманню ОЛП зі збільшеною в 1,2 рази протеолітичною активністю (389 од/г), пролонгованої дії, стабільністю при г-стерилізації і зберіганні протягом 1 року. Встановлено, що іммобілізація папаїну відбувається за рахунок невалентних взаємодій з ПВС, сечовини - шляхом механічного включення. Проведені медико-біологічні випробування ОЛП з папаїном і сечовиною показали перспективність їх використання в опіковій терапії очей.
4. На основі модифікованого золем полікремнієвої кислоти полі-N-вінілпіролідону вперше розроблені ранові водонерозчинні гідрогелеві покриття з іммобілізованими лужною протеазою і трипсином, з високими виходами по активності (75,6-100 %), стійкі при зберіганні і г-стерилізації, пролонгованої дії (24 год). Дослідження співвідношень матриця-фермент, кінетичних параметрів гідролізу субстрату вільним і іммобілізованим ферментом, виявлення дозозалежного ефекту при г-опроміненні, надає можливість оптимізації дози і, відповідно, протеолітичної активності іммобілізованого препарату.
5. Наявність протеолітичної активності білкових фракцій протеази С як в кислому (РН 4,9), так і в лужному (РН 8,9) середовищах (нативний електрофорез у ПААГ) дозволила вперше на основі природного біогелю «Ламідан» отримати текстильне покриття з іммобілізованим ферментом, з високим ступенем збереження протеолітичної активності (95,9 %), пролонгованої дії, тривалого терміну зберігання (1,5 роки) для потенційного вживання в рановій і опіковій терапії.
6. Розроблені лабораторний регламент на ОЛП з папаїном і сечовиною і проекти АНД на іммобілізовану лужну протеазу і ОЛП з папаїном і сечовиною.
Список литературы
1. Романовська І.І. Розробка ранового гідрогелевого покриття з іммобілізованою лужною протеазою Bacillus subtilis на основі модифікованого полі-N-вінілпіролідону / І.І. Романовська, С.С. Декіна // Досягнення біології та медицини. - 2007. - № 1. - С. 88-91. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення матеріалу, написання статті.
2. Романовська І.І. Іммобілізація папаїну та сечовини в полівініловий спирт / І.І. Романовська, С.С. Декіна // Медична хімія. - 2007. - №1. - С. 35-40. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення матеріалу, написання статті, написання та підготовка статті до друку.
3. Романовская И.И. Некоторые особенности кинетики гидролиза казеина папаином, трипсином и щелочной протеазой из Bacillus subtilis / И.И. Романовская, С.С. Декина, О.В. Севастьянов // Ученые записки ТНУ, Сер. «Биология, химия». - 2007. - Т. 20 (59), № 2. - С. 126-130. Особистий внесок здобувача: проведення кінетичних досліджень, узагальнення матеріалу, написання статті.
4. Романовська І.І. Розробка очних лікарських плівок з сироватковим альбуміном людини / І.І. Романовська, С.С. Декіна, Р.І. Чаланова, Г.В. Глущак // Медична хімія. - 2008. -Т. 10, № 1.-С. 15-19. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання і підготовка статті до друку.
5. Романовська І.І. Іммобілізація протеази С в біогель ламідан / І.І. Романовська, С.С. Декіна, Н.Б. Мартинюк // Досягнення біології та медицини. - 2009.- Т. 14, № 2. - С. 25-28. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, написання і підготовка статті до друку.
6. Романовская И.И. Иммобилизация биологически активных веществ с целью создания потенциальных диагностических и лекарственных средств / И.И. Романовская, Т.И. Давиденко, С.С. Декина, И.И. Пашкин, С.А. Андронати // Журнал орг. та фарм. хімії. - 2009. - Т.7, вип. 3(27). - С. 69-78. Особистий внесок здобувача проведення досліджень, участь у написанні статті.
7. Романовская И.И. Иммобилизация щелочной протеазы и лизоцима в модифицированный поли-N-винилпирролидон / И.И. Романовская, С.С. Декина, И.И. Пашкин //Хим.-фарм. журн. - 2009. - Т.43, №10. - С. 88-91. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання статті.
8. Пат. 13238, Україна, МПК(2006) A61F 9/007 Романовська І.І., Декіна С.С., Бондаренко Г.І., Чаланова Р.І., Якіменко С.А., Давиденко Т.І. Композиція інгредієнтів для очної лікарської плівки. Заявка № 4200602317. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, підготовка матеріалу до написання патенту.
9. Пат. 26190, Україна, МПК (2006) А61F 9/007 Романовська І.І., Декіна С.С., Чаланова Р.І., Глущак М.А. Композиція інгредієнтів для очної лікарської плівки. Заявка № u 2007 04273. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, підготовка матеріалу до написання патенту.
10. Пат. 22088, Україна, МПК(2006) A61L 15/16 Романовська І.І., Декіна С.С., Пашкін І.І., Пухлік С.М. Ранозагоювальний засіб. Заявка № u 2006 12771. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, підготовка матеріалу до написання патенту.
11. Пат. 31802, Україна, МПК(2006) С12N 11/00 Романовська І.І., Декіна С.С. Спосіб іммобілізації протеази С. Заявка № u 2007 13120. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, підготовка матеріалу до написання патенту.
12. Пат. 83786, Україна, МПК(2006) С12N 11/00 Романовська І.І., Декіна С.С. Спосіб іммобілізації протеази С. Заявка № a 2007 13084. Декіна С.С. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, підготовка матеріалу до написання патенту.
13. Декина С.С. Иммобилизация сывороточного альбумина человека в поливиниловый спирт / С.С. Декина, И.И. Романовская // «Наука и образование - 2006»: Международная научно-техническая конференция, Мурманск, 4-12 апреля 2006 г. - Мурманск, 2006. - С. 645. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
14. Декина С.С. Изучение термической инактивации щелочной протеазы из Bacillus subtilis, иммобилизованной в модифицированный поли-N-винилпирролидон / С.С. Декина, Ю.А. Шестеренко, И.И. Романовская // I Всеукраїнська конференція студентів, аспірантів та молодих вчених, Київ, 27-29 квітня 2006р. - Київ, 2006. - С. 188 Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
15. Декина С.С. Иммобилизация щелочной протеазы из Bacillus subtilis в модифицированный диоксидом кремния поли-N-винилпирролидон / С.С. Декина, И.И. Романовская, И.И. Пашкин // «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии»: Материалы международной научной конференции, Минск, 1-2 июня 2006 г. - Минск, 2006. - С. 365-366. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
16. Декина С.С. Разработка потенциального противораневого полимерного покрытия на основе поли-N-винилпирролидона с иммобилизованной щелочной протеазой / С.С. Декина, И.И. Романовская, Ю.А. Шестеренко //«Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006» Конференція-конкурс робіт молодих учених, Київ, 6-7 червня 2006. - Киев, 2006. - С. 11. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
17. Декина С.С. Разработка противораневого гидрогелевого покрытия с иммобилизованной протеазой из Bacillus subtilis / С.С. Декина, И.И. Романовская // «Биотехнология. Образование. Наука. Практика»: III Всеукраинская научно-практическая конференция с международным участием, Харьков, 18-20 октября 2006. - Харьков, 2006 - С. 152. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
18. Декина С.С. Разработка иммобилизованных форм белковых и протеолитических ферментных препаратов / С.С. Декина, И.И. Романовская // «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: материалы Четвертого Московского международного конгресса, Москва, 12-16 марта 2007. - Москва, 2007. - С. 94. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
19. Декина С.С. Изучение кинетики гидролиза казеина щелочной протеазой Bacillus subtilis / С.С. Декина, И.И. Романовская, О.В. Севастьянов // II Всеукраїнська конференція студентів, аспірантів та молодих вчених, Київ, 26-28 квітня 2007. - Киев, 2007. - С. 25. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
20. Dekina S. Investigation of casein hydrolysis kinetics by papain, trypsin and Bacillus subtilis alkaline protease / S. Dekina, I. Romanovskaya, O. Sevastyanov // «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution»: Materials of III International Young Scientists Conference, Odessa, 15 - 18 May 2007. - Odessa, 2007. - P. 182. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
21. Dekina S.S. The development of ocular antiburn films with immobilized human serum albumin / S.S. Dekina, I.I. Romanovskaya // «Modern problems of microbiology and biotechnology»: The young scientists’ and students’ international scientific conference, Odessa, 28 - 31 May 2007 - Odessa, 2007. - P. 138. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
22. Dekina S.S. The development of antiwound hydrogel coating with immobilized trypsin / S.S. Dekina // Conference for young scientists, PHD students and students on molecular biology and genetics. Dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov, Kyiv, 20-22 september 2007. - Київ, 2007. - С. 113. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
23. Декина С.С. Иммобилизация протеазы С в ламидан / С.С. Декина, Ю.С. Каравелкова // X коференція молодих учених та студентів-хіміків Південного регіону України, Одеса, 16-17 жовтня 2007. - Одеса, 2007. - С. 15. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
24. Романовская И.И. Потенциальные раневые покрытия с протеазами микробного происхождения / И.И. Романовская, С.С. Декина // XII зїзд Товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського, Ужгород, 25-30 травня 2009 р. - Ужгород, 2009. - С. 247. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.
25. Romanovska I. Potentially wound coating with alkaline protease from Bacillus subtilis immobilized on modified poly-N-vinyl pyrrolidone / I. Romanovska, S. Dekina, I. Pashkin, V. Topticov // “Microbiology on Service for Human”: 3rd Ukranian-Polish Weigl Conference, Odessa, 14-17 September 2009. - Odessa, 2009. - P. 103-104. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.