Лімфоцитопосередковані механізми за умов хронічної гіперімунокомплексемії та вплив на них корвітину в експерименті - Автореферат

Патогенетичну основу токсичної дії оксиду азоту, за цих умов, складає його спряжена реакція із супероксид-аніон радикалом, результатом якої є утворення пероксинітриту, а посилення некомпенсованої генерації вільних радикалів призводить до руйнування клітинних компонентів, розвитку метаболічно-імунної дизадаптації та формування тяжких системних патологій (Коцюруба А.В., 2000; Lum H., Roebuck K.A., 2001; Мисула І.Р., 2007). Таким чином, зясування особливостей NO-синтазного та аргіназного шляхів метаболізму L-аргініну у лімфоцитах і ендотеліоцитах, за умов застосування корвітину, дозволить краще зрозуміти основні клініко-патогенетичні закономірності розвитку імунокомплексного процесу, можливості його попередження та адекватної фармакологічної корекції. Дослідити особливості NO-синтазного і аргіназного шляхів метаболізму L-аргініну в лімфоцитах і ендотеліоцитах при їх сумісній інкубації in vitro, в нормі та за умов хронічної гіперімунокомплексемії. Дослідити NO-синтазний та аргіназний шляхи метаболізму L-аргініну в лімфоцитах і ендотеліоцитах в нормі та при хронічній гіперімунокомплексемії за умов in vivo. Методи дослідження: з метою вивчення особливостей функціонально-структурних змін лімфоцитів та ендотеліоцитів за умов хронічної гіперімунокомплексної патології в експерименті були застосовані такі методи: виділення клітин (виділення лімфоцитів - на градієнті щільності фекол-верографіну, виділення ендотеліальних клітин - метод ферментативного диспергування); імунологічні (визначення вмісту ЦІК методом преципітації в ПЕГ, визначення активності системи комлементу); біохімічні (визначення ферментативної активності NO-синтаз - INOS та CNOS, рівня стабільних метаболітів оксиду азоту - NO2Ї і NO3Ї, вмісту нітрозоглутатіону - GSNO та активності аргінази і сечовини); морфологічні (дослідження ультратонкої структури лімфоцитів та ендотеліоцитів методом електронної мікроскопії); математичні (статистичне опрацювання одержаних результатів).У процесі дослідження використано 200 тварин, яких розподіляли на групи: перша - інтактні тварини, які отримували плацебо і служили контролем; друга - тварини із змодельованою і верифікованою лабораторними дослідженнями хронічною гіперімунокомплексемією; третя - інтактні тварини, які отримували корвітин; четверта - тварини із змодельованою і верифікованою лабораторними дослідженнями хронічною гіперімунокомплексемією, які отримували корвітин. Для реалізації поставленої мети, першим етапом нашої роботи було дослідження процесів NO-синтазної та аргіназної активності в ізольованих лімфоцитах та ендотеліальних клітинах при їх інкубації за умов норми і хронічної гіперімунокомплексемії. Стосовно активності аргінази, то в умовах сумісної інкубації клітин, в ендотеліоцитах виявлено зменшення її активності у 2,5 раза (Р<0,05). Отже, отримані результати дозволяють припустити, що при хронічному гіперімунокомплексному процесі пониження синтезу оксиду азоту в активованих лімфоцитах прямо або опосередковано призводить до зміни в процесах його синтезу у ендотеліальних клітинах, що в подальшому може призвести до порушення функціональної здатності ендотелію та ушкодження судин. Отже, отримані експериментальні дані свідчать, що в умовах in vitro протекторні особливості водорозчинної форми корвітину повязані, перш за все, із його здатністю специфічно пригнічувати активність індуцибельної NO-синтази, без інгібування активності її конститутивної ізоформи в лімфоцитах і, особливо, в ендотеліальних клітинах за умов хронічної гіперімунокомплексної патології.Описані ультраструктурні особливості цих клітин і запропоновано нові підходи до корекції порушень, зумовлених хронічним гіперімунокомплексним процесом, за допомогою корвітину. Розвиток хронічної гіперімунокомплексемії підтверджується зростанням показників ЦІК різної молекулярної маси та зниженням показника гемолітичної активності комплементу. Аналіз кооперативної взаємодії лімфоцитів та клітин ендотелію у тварин із хронічною гіперімунокомплексемією показав зниження активності CNOS в лімфоцитах - 2,2 раза і в ендотеліальних клітинах - 1,3 раза із одночасним наростанням активності INOS у цих клітинах: в лімфоцитах - 4 рази та ендотеліоцитах - 1 раз. Розвиток хронічної гіперімунокомплексемії супроводжують наступні зміни метаболізму NO-синтазного шляху: зростання активності INOS у лімфоцитах - 4,7 раза, в ендотеліоцитах в 2 рази та інгібування потенціалу CNOS у лімфоцитах-2,6 раза і в 1,6 раза в ендотеліоцитах. Хронічний гіперімунокомплексний процес характеризується зростанням показників аргіназного шляху метаболізму L-аргініну: активність аргінази у лімфоцитах підвищується у 5,1 раза, в ендотеліоцитах в 1,6 раза; вміст сечовини у лімфоцитах збільшується у 3,9 раза, в ендотеліоцитах - 1,9 раза.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У дисертаційній роботі наведені нові теоретичні узагальнення результатів дослідження особливостей метаболізму L-аргініну та його звязку з лімфоцитарно-ендотеліальними асоціаціями за умов норми та хронічної гіперімунокомплексної патології. Описані ультраструктурні особливості цих клітин і запропоновано нові підходи до корекції порушень, зумовлених хронічним гіперімунокомплексним процесом, за допомогою корвітину. В результаті вирішення наукового завдання зроблено наступні висновки: 1. Розвиток хронічної гіперімунокомплексемії підтверджується зростанням показників ЦІК різної молекулярної маси та зниженням показника гемолітичної активності комплементу.

2. Аналіз кооперативної взаємодії лімфоцитів та клітин ендотелію у тварин із хронічною гіперімунокомплексемією показав зниження активності CNOS в лімфоцитах - 2,2 раза і в ендотеліальних клітинах - 1,3 раза із одночасним наростанням активності INOS у цих клітинах: в лімфоцитах - 4 рази та ендотеліоцитах - 1 раз. Паралельно виявлена активація аргінази і підвищення вмісту сечовини, що більше виражено у лімфоцитах.

3. Розвиток хронічної гіперімунокомплексемії супроводжують наступні зміни метаболізму NO-синтазного шляху: зростання активності INOS у лімфоцитах - 4,7 раза, в ендотеліоцитах в 2 рази та інгібування потенціалу CNOS у лімфоцитах-2,6 раза і в 1,6 раза в ендотеліоцитах.

4. Хронічний гіперімунокомплексний процес характеризується зростанням показників аргіназного шляху метаболізму L-аргініну: активність аргінази у лімфоцитах підвищується у 5,1 раза, в ендотеліоцитах в 1,6 раза; вміст сечовини у лімфоцитах збільшується у 3,9 раза, в ендотеліоцитах - 1,9 раза.

5. Розвиток хронічної гіперімунокомплексемії зумовив пониження рівнів нітрат- і нітрит - аніонів як в лімфоцитах, так і в клітинах ендотелію. Ці зміни (більш виражені у лімфоцитах) можна розцінити як розвиток нітрозактивного стресу в досліджуваних клітинах. Зменшення вмісту нітрозоглутатіону (також більш виражене в лімфоцитах) свідчить про пониження системи антиоксидантного захисту за цих умов.

6. Хронічний гіперімунокомплексний процес супроводжується порушенням морфофункціонального стану лімфоцитів та ендотеліоцитів. Зміни в лімфоцитах характеризуються переважанням деструктивних процесів із елементами початкового некрозу. Морфологічні дослідження стінки аорти білих щурів виявляють значні порушення ендотеліального шару судинної стінки внаслідок відкладання імунних комплексів.

7. Застосування корвітину, на тлі хронічної гіперімунокомплексемії, призвело до зниження концентрації ЦІК різної молекулярної маси та зростання показників комплементарної активності сироватки крові.

8. Корвітин в умовах in vitro, проявляючи інгібуючий вплив на активність INOS та вміст аргінази і сечовини, як в лімфоцитах так і в ендотеліоцитах, не впливає при цьому на активність CNOS, що підтверджує його селективну дію за умов хронічної гіперімунокомплексемії.

9. Застосування корвітину зумовлює корекцію змін NO-синтазного шляху, що свідчить про його гальмуючий вплив на розвиток нітрозактивного стресу в клітинах, та, інгібуючи надмірний синтез аргінази, сприяє відновленню порушеного балансу в метаболізмі L-аргініну.

10. Застосування корвітину зумовлює нормалізацію морфологічних змін лімфоцитів та ендотеліоцитів, що підтверджує його цитопротекторну і мембраностабілізуючу дію за умов хронічної гіперімунокомплексемії.

1. Вплив корвітину на ультраструктури синусоїдних гемокапілярів печінки білих щурів за умов хронічної гіперімунокомплексної патології /Качмарська М.О., Чопяк В.,В., Любінець Л. А., Ковалишин В.І., Садляк О.В., Вальчук І.В. // Клінічна та експериментальна патологія. - 2004. - Т.3, №2. - С. 436-438. (Дисертант самостійно проводила моделювання хронічної гіперімунокомплексемії та її корекції, брала участь у статистичному опрацюванні результатів).

2. Ультраструктурні особливості лімфоцитів та ендотеліоцитів за умов хронічної гіперімунокомплексемії /Садляк О.В., Чопяк В.В., Бідюк М.М., Любінець Л.А., Качмарська М.О. //Буковинський медичний вісник. - 2006. - №3. - С. 120-123. (Дисертант брала участь у підготовці зразків для дослідження, аналізі експериментальних даних, підготувала статтю до публікації).

3. Дослідження ультраструктури стінки аорти за умов хронічної гіперімунокомплексемії /Садляк О.В., Чопяк В.В., Бідюк М.М., Любінець Л.А., Качмарська М.О. //Вісник наукових досліджень. - 2006. - №4. - С. 41-44. (Дисертант брала участь у підготовці зразків для дослідження, опрацюванні результатів експериментальних даних, підготувала статтю до публікації).

4. NO-залежні механізми взаємодії лімфоцитів і ендотеліоцитів білих щурів при їх інкубації in vitro за умов хронічної гіперімунокомплексемії та коригуючий вплив корвітину на ці процеси /Садляк О.В., Чопяк В.В., Любінець Л.А., Качмарська М.О. //Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2007. - №1 (37). - С. 7-11. (Дисертант самостійно провела методику виділення ендотеліальних клітин, брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні отриманих результатів, підготувала статтю до публікації).

5. Гіперімунокомплексний синдром в експерименті та клініці /Чопяк В.В., Вальчук І.В., Гайдучок І. Г., Садляк О.В., Качмарська М.О., Никитюк Г.П. //Вісник наукових досліджень. - 2007. - №1. - С. 5-8. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень).

6. Хронічний гіперімунокомплексний синдром: коригуючий вплив корвітину на метаболізм L-аргініну в лімфоцитарно-ендотеліальних взаємодіях in vitro /Садляк О.В., Чопяк В.В., Вальчук І.В. Гайдучок І.Г. //Імунологія та алергологія. - 2007. - №1. - С. 63-66. (Дисертант проводила виконання досліджень та статистичну обробку резельтатів).

7. Садляк О.В. Ефекти NO та його стабільних метаболітів у лімфоцитах білих щурів при експериментальному хронічному гіперімунокомплексному синдромі в умовах in vivo //Медична хімія. - 2007. - Т.9, № 3.- С. 33-36.

8. Садляк О.В. Регуляторна і дисрегуляторна роль системи L-аргінін-оксид азоту в лімфоцитах білих щурів за умов хронічного гіперімунокомплексного синдрому //Здобутки клінічної та експериментальної медицини - 2007. № 2 (7). -

С. 143 - 146.

9. Деклараційний патент на корисну модель 13287, Україна МПК А61К 31/33. Застосування корвітину як ендотеліопротектора за умов гіперімунокомплексного синдрому: Пат.13287 МПК А61К 31/33 / Чопяк В.В., Мойбенко О.О., Вальчук І.В., Качмарська М.О., Бідюк М.М., Любінець Л.А., Садляк О.В., Павлович С.І. (Україна).- № u200509991; Заяв. 24.10.2005; Опубл.15.03.06. Бюл.№3. (Дисертант самостійно проводила моделювання хронічної гіперімунокомплексемії та її корекції, брала участь в опрацюванні, аналізі отриманих результатів і підготовці патенту до публікації).

10. Чопяк В.В., І.В. Вальчук І.В., Садляк О.В. Вплив корвітину на рівень циклічних нуклеотидів у щурів за умов хронічної гіперімунокомплексемії. //Імунологія та алергологія. /Тези доп. VIII наук.-практ. звітно-виборчої конф. Українського товариства фахівців з імунології, алергології та імунореабілітації “Сучасні аспекти діагностики та лікування імуно - та алергопатології“. - 2006. - №2 - С.-127 (Дисертант брала участь у статистичному опрацюванні результатів та аналізі експериментальних даних).

11. Садляк О.В. Коригуючий вплив корвітину на NO-синтазний шлях оксиду азоту в лімфоцитах білих щурів за умов хронічної гіперімунокомплексемії. //Тези доповідей наук.-прак. конф. ”IV чтение им. В.В. Подвысоцкого“. - Одеса, 2007. - С. 103 - 104.

12. Вплив корвітину на систему циклічних нуклеотидів у моноцитах білих щурів хронічного гіперімунокомплексного процесу /Качмарська М.О., Чопяк В.В., Любінець Л.А., Садляк О.В. //Тези доп. наук.-прак. конф. ”IV чтение им. В.В. Подвысоцкого“. - Одеса, 2007. - С. 72 - 73. (Дисертант брала участь у статистичному опрацюванні результатів, провела пошук літератури у науковій бібліотеці та мережі Medline).

13. Садляк О.В. Вплив корвітину на показники системи оксиду азоту в ендотеліоцитах білих щурів за умов хронічної гіперімунокомплексемії //Тези доп. підсумкової наук.-прак. конф. ”Здобутки клінічної і експериментальної медицини“. - Тернопіль, 2007. - С. 149 - 150.

14. Садляк О. В. Характеристика окисного і неокисного шляху метаболізму L-аргініну в лімфоцитах білих щурів, за умов хронічного гіперімунокомплексного синдрому і стабілізуючий вплив корвітину на ці процеси //Тези доп. ІІІ міжнародної наук. конф. ”Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка“. - Одеса, 2007. - С. 46 - 48.

15. Особливості синтазного та аргіназного шляхів метаболізму NO в ендотеліоцитах білих щурів за умов хронічного гіперімунокомплексного синдрому /О.В. Садляк, В.В. Чопяк, Л.А. Любінець, М.О. Качмарська, І.В. Вальчук //Медична хімія. /Тези доповідей наук.-практ. конф. ”Роль месенжерних систем у патогенезі патологічних процесів різної етіології“. - 2007. - Т.9, № 4. - С. 69-70. (Дисертант самостійно проводила моделювання хронічної гіперімунокомплексемії, проаналізувала дані експериментальних досліджень та підготувала тези до друку).