Обґрунтування біологічної чутливості еритроцитів у ссавців. Дослідження можливих трансформацій структурно-функціонального стану деконсервованих клітин. Характеристика морфологічних показників еритроцитів коня, бика і собаки після кріоконсервування.
Аннотация к работе
Тому дослідження стійкості еритроцитів, що відрізняються особливостями будови та організації мембрани, при дії кріопротекторів і інших чинників низькотемпературного консервування дозволить чіткіше виявити причини кріочутливості та розробити методи, спрямовані на підвищення збереженості клітин в умовах заморожування-відігрівання. Робота виконана відповідно до наукового напрямку роботи кафедри хімії і біохімії Харківської державної зооветеринарної академії МАП України в рамках теми: “Експериментальне обґрунтування та розробка методів кріоконсервування клітин та тканин домашніх і сільськогосподарських тварин”, № держреєстрації 0104U009818 та у відділі кріоцитології та кількісної морфології Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за темою: “Вивчення молекулярних механізмів структурно-функціональних змін плазматичних мембран і цитоскелета еритроцитів донорської і кордової крові людини під впливом температурно-осмотичних ефектів і кріпротекторів різного механізму дії”, № держреєстрації 0104U006436, де автор самостійно виконувала окремі розділи. Мета роботи - вивчити чутливість еритроцитів різних видів ссавців (кінь, бик і собака) до кріоконсервування під захистом кріопротекторів різного механізму дії і оцінити структурно-функціональний стан деконсервованих клітин. Оцінити збереження еритроцитів коня, бика і собаки після кріоконсервування з проникаючими (гліцерин, ДМСО) і непроникаючим (ПЕО-1500) кріопротекторами, а також після повернення деконсервованих клітин до фізіологічних умов; Вивчити характер модифікації просторового упакування білків мембранно-цитоскелетного комплексу еритроцитів коня, бика і собаки за даними гель-електрофорезу після інкубації еритроцитів з кріопротекторами, заморожування-відігрівання і повернення деконсервованих клітин до фізіологічних умов.Матеріалом дослідження були еритроцити донорської крові коня, бика, собаки, яку заготовляли на глюгіцировому консерванті. Визначення концентрації 2,3-ДФГ в еритроцитах проводили за методом. Співвідношення захисної дії кріопротектора і його цитотоксичного ефекту залежить від багатьох факторів: умов інкубації, концентрації, температури, швидкості введення кріопротектора до клітинної суспензії. При перенесенні еритроцитів коня, бика і собаки, кріоконсервованих з ДМСО після видалення кріопротектора з клітин до ізотонічного середовища при 37°С, відзначається їх стабільність, тоді як після заморожування з ПЕО-1500 відбувається їх пошкодження, яке супроводжується зростанням гемолізу протягом 24 годин дослідження. Це свідчить про те, що в клітинах після заморожування-відігрівання з ПЕО-1500 значно порушуються механоеластичні властивості, і клітини стають крихкішими і менш еластичними.Механізми кріочутливості еритроцитів людини достатньо вивчено та розроблено ефективні методи їх кріоконсервування, однак для еритроцитів тварин цей напрямок дослідження залишається досить актуальним. У дисертаційній роботі представлено теоретичне узагальнення наукової проблеми щодо порівняльного вивчення чутливості еритроцитів ссавців до кріоконсервування у присутності кріопротекторів проникаючого і непроникаючого типів, а також розробки підходів, спрямованих на зменшення пошкодження клітин в процесі кріоконсервування: 1. Еритроцити, кріоконсервовані з ДМСО, порівняно з ПЕО-1500 проявляють високу стійкість (контролю) в моделі трансфузії з підтримкою нормальної осмотичної крихкості; біологічний еритроцит кріоконсервування Виявлено морфологічні зміни клітин при кріоконсервуванні в присутності кріопротекторів.
План
. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Вывод
Механізми кріочутливості еритроцитів людини достатньо вивчено та розроблено ефективні методи їх кріоконсервування, однак для еритроцитів тварин цей напрямок дослідження залишається досить актуальним. У дисертаційній роботі представлено теоретичне узагальнення наукової проблеми щодо порівняльного вивчення чутливості еритроцитів ссавців до кріоконсервування у присутності кріопротекторів проникаючого і непроникаючого типів, а також розробки підходів, спрямованих на зменшення пошкодження клітин в процесі кріоконсервування: 1. Встановлено, що гліцерин не здатний забезпечити захист еритроцитів досліджених тварин при низькотемпературному консервуванні. Високе збереження клітин досягається при використанні ДМСО і ПЕО-1500. Еритроцити, кріоконсервовані з ДМСО, порівняно з ПЕО-1500 проявляють високу стійкість (контролю) в моделі трансфузії з підтримкою нормальної осмотичної крихкості; біологічний еритроцит кріоконсервування
2. Коефіцієнт проникності мембран еритроцитів коня, бика та собаки для гліцерину значно нижчий, ніж для ДМСО;
3. Найбільш стійкими до процесу кріоконсервування у присутності кріопротекторів різного механізму дії є еритроцити собаки, найменш стійкими - еритроцити коня;
4. Виявлено морфологічні зміни клітин при кріоконсервуванні в присутності кріопротекторів. У випадку ДМСО після заморожування-відігрівання та видалення з клітин кріопротектора спостерігається ехіноцитоз, а після перенесення деконсервованих еритроцитів до аутоплазми відновлюється їх початкова форма. При кріоконсервуванні еритроцитів з ПЕО-1500 спостерігається стоматоцитоподібна трансформація, яка зберігається і після повернення клітин до фізіологічних умов;
5. При кріоконсервуванні еритроцитів ссавців з ДМСО і ПЕО-1500 вміст АТФ і 2,3-ДФГ зберігається на рівні контролю. При моделюванні трансфузії концентрації цих макроергів в еритроцитах, кріоконсервованих у присутності ПЕО-1500, достовірно знижується в процесі інкубації, що не характерно для контрольних і кріоконсервованих з ДМСО клітинами;
6. Кріоконсервування еритроцитів у присутності ПЕО-1500 і ДМСО призводить до модифікації білкового спектру мембран, яка виявляється методом електрофорезу із застосуванням діаміду. При кріоконсервуванні з ПЕО-1500 модифікація мембранно-цитоскелетеного комплексу більш виражена.
ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ
1. Денисова О.Н., Кулешова Л.Г., Землянских Н.Г., Жегунов Г.Ф. Трансформация эритроцитов животных после криоконсервирования // Вісник проблем біології і медицини. - 2005. - Вип. 4. - С. 41-45.
2. Денисова О.Н., Жегунов Г. Ф., Бабийчук Л. А. Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленгликоля, глицерина // Проблемы криобиологии. - 2005. - №2.
3. Жегунов Г.Ф., Денисова О.Н., Землянских Н.Г. Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 3. - №3. - С. 566-569.
4. Денисова О.Н. Исследование уровня 2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах животных после низкотемпературного консервирования под защитой диметилсульфоксида и полиэтиленоксида мм. 1500 // Вісник проблем біології і медицини. - 2005. - Вип. 3. - С. 33-38.
5. Денисова О.М., Жегунов Г.Ф., Бабійчук Л.О. Кріоконсервування еритроцитів тварин під захистом поліетиленоксида // Біологія тварин. - 2004. - Т. 6. - №1-2. - С. 107-110.
6. Жегунов Г.Ф., Денисова О.Н. Резистентность эритроцитов домашних животных к криоконсервированию // Ветеринарна медицина. - 2005. - Т. 1. - С. 433-434.
7. Денисова О.М. Стійкість еритроцитів коня, бика, собаки до кріоконсервування: Тези доповідей 1 Міжнародної конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ в біології.” - Львів, 2005. - С. 13.
8. Денисова О.Н. Вивчення ефекту диметилсульфоксиду та поліетиленгліколя при кріоконсервуванні еритроцитів бика, коня: Тези конференції-конкурсу робіт молодих учених, присвяченої 100-річчю від Дня народження М.Ф. Гулого. - Київ, 2005. - С. 12.
9. Денисова О.Н., Землянских Н.Г., Жегунов Г.Ф. Структурные изменения мембран эритроцитов животных при криоконсервировании под защитой ПЭО-1500: Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції „Дні науки 2005”. - Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2005. - Т. 2. „Біологія.” - С. 17-18.