Корекція екпериментального гіпотиреозу шляхом комбінованої трансплантації органотипових культур - Автореферат

Захист відбудеться 28 травня 2008 р. о 15:15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. З дисертацією можна ознайомитись у центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. У випадках первинного гіпотиреозу, коли причинами гормональної недостатності могли стати спадкові дефекти в біосинтезі тиреоїдних гормонів, ембріональні гіпо-і аплазії залози, субтотальна або тотальна тиреоїдектомія та при умові відсутності аутоімунного компоненту захворювання, альтернативою лікування синтетичними гормонами може бути трансплантація ЩЗ (органотипових і клітинних культур). У звязку з деякими протиріччями в літературних даних з дослідження дії глюкокортикоїдів на функціональну активність щитоподібної залози in vivo та in vitro і обмеженими даними про комбіновану трансплантацію двох видів ендокринних тканин, детальне вивчення зазначеної проблеми вважається актуальним. Метою даної роботи було дослідження структурно-функціональних характеристик моно-і комбінованих органотипових культур щитоподібних, надниркових залоз і гіпофіза in vitro та in vivo - за умов трансплантації тваринам з післяопераційним гіпотиреозом.Експерименти на лабораторних тваринах проводились відповідно принципам Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (1964-2000 р.р.), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (1997 р.), відповідним положенням ВООЗ, Міжнародної ради медичних наукових товариств, вимогам та нормам 1СН С8Р (2002 р.), типовим положенням з питань етики МОЗ України № 281 від 1 листопада 2000 р., відповідно до положень нормативних документів, введених в дію наказом МОЗ України № 6 від 17 січня 1995 р., а також вимогам “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та наукових цілях” (1986 р. На етапі передобробки трансплантаційного матеріалу проводилось органотипове культивування ендокринних тканин, комбіноване культивування і культивування в присутності модифікаторів гормонопоезу. Для комбінованого культивування 2 видів ендокринних тканин на 3 добу фрагменти ЩЗ і НЗ, а також ЩЗ і експлантати гіпофізу відокремлювали напівпроникливою мембраною і інкубували 24 години, дотримуючись стандартних умов. Для визначення здатності ОКЩЗ відповідати на дію модифікаторів гормонопоезу, на 3 добу культивування в середовище додавали ТТГ (10 МКМО/мл (Sadeh K. et al., 1991)) та інкубували 12 годин при температурі 37ЄС, тиротропін-рилізинг гормон (ТРГ) в 2 концентраціях (10 нмоль (4,4 нг/мл)) - на 12 годин (Weintraub B.D. et al., 1990) і 200 мкг/мл - на 2 години інкубації (Cheolyoung P. et al., 2005)), дибутирил-циклічного аденозинмонофосфату (дб-ЦАМФ) (1 ммоль/мл), кортикостерон (в діапазоні концентрацій від 0,25 до 1,0 мкг/мл (Резников А.Г., 1980)). Вміст загального рівня тироксину (Т4) в плазмі крові тварин-реципієнтів і середовищі культивування дослідних зразків ОКЩЗ визначали методом радіоімунологічного аналізу з використанням стандартних тест-наборів РИА - Т4 - СТ (Білорусь) (Прядко К.А. и др., 2000) и Т4 Immunotech (Чехія) згідно з інструкцією.В дисертаційній роботі, відповідно до встановленої мети і задач, наведено нові дані щодо визначення впливу глюкокортикоїдів на Т4-гормонопоез, розроблено метод комбінованого культивування двох видів ендокринних тканин і обгрунтовано доцільність його використання з метою покращення морфофункціональних параметрів трансплантаційного матеріалу. Встановлено компенсаторний ефект комбінованої ало-і ксенотрансплантації нативних фрагментів та органотипових культур щитоподібних залоз щурів і новонароджених поросят попередньо культивованих із тканиною надниркових залоз і експлантатами гіпофізу на тиреоїдний статус та метаболічні процеси в організмі тварин-реципієнтів з післяопераційним гіпотиреозом.

Основний зміст роботи

В дисертаційній роботі, відповідно до встановленої мети і задач, наведено нові дані щодо визначення впливу глюкокортикоїдів на Т4-гормонопоез, розроблено метод комбінованого культивування двох видів ендокринних тканин і обгрунтовано доцільність його використання з метою покращення морфофункціональних параметрів трансплантаційного матеріалу. Встановлено компенсаторний ефект комбінованої ало- і ксенотрансплантації нативних фрагментів та органотипових культур щитоподібних залоз щурів і новонароджених поросят попередньо культивованих із тканиною надниркових залоз і експлантатами гіпофізу на тиреоїдний статус та метаболічні процеси в організмі тварин-реципієнтів з післяопераційним гіпотиреозом.

1. Органотипові культури щитоподібних залоз щурів і новонароджених поросят in vitro та in vivo (при трансплантації гіпотиреоїдним щурам) зберігали свої функціональні властивості, які виявлялися у збереженні гормонопоетичної активності і здатності відповідати на специфічну і неспецифічну стимуляцію шляхом підвищення рівня тироксину в плазмі крові та середовищі культивування.

2. Максимально ефективними в корекції гіпотиреоїдного стану та повязаних з ним метаболічних порушень виявилися комбіновані ксенографти нативних фрагментів щитоподібних і надниркових залоз, що підтверджується нормалізацією рівня тироксину, тиротропіну та біохімічних показників в плазмі крові тварин-реципієнтів, а також збереженням фолікулярної структури тиреоїдної тканини та її здатності до регенерації на 30 добу після трансплантації.

3. Комбіновані ало- і ксенотрансплантації сумісно культивованих щитоподібних і надниркових залоз сприяли більш ефективній компенсації тиреоїдної недостатності порівняно з трансплантаціями окремо культивованих тканин.

4. Після комбінованої алотрансплантації сумісно культивованих щитоподібних залоз з експлантатами гіпофізу в плазмі крові тварин-реципієнтів спостерігалося зростання рівня тироксину на 41,5% порівняно з трансплантацією окремо культивованих тканин.

5. Комбіновані ауто-, ало- та ксенографти нативних фрагментів щитоподібних і надниркових залоз характеризувалися максимальною збереженістю гістоструктури, здатністю тиреоїдної паренхіми до регенерації, відсутністю процесів відторгнення.

6. Метод комбінованого культивування щитоподібних залоз з тканинами надниркових залоз і гіпофізу доцільно застосовувати в якості одного із способів передобробки трансплантаційного матеріалу з метою збереження достатньої кількості життєздатних клітин, посилення гормонопродукуючої активності, зниження імуногенності і збільшення терміну функціонування графта в організмі реципієнта.

1. Бондаренко Т.П., Билявская С.Б., Алабедалькарим Н.М., Божок Г.А. Регуляция тиреоидной секреции специфическими и неспецифическими стимуляторами гормонопоэза in vitro // Трансплантологія. - 2005. - Т. 8, № 4. - С. 67-70. Здобувачем проведено: експлантація ЩЗ, НЗ, гіпофізів щурів, отримання органотипових та комбінованих культур, розробка методу комбінованого культивування 2 видів ендокринних тканин, визначення життєздатності клітин в культурі, інкубація органотипових культур в присутності специфічних та неспецифічних стимуляторів гормонопоезу, визначення базальної та стимульованої секреції тироксину, статистична обробка результатів.

2. Білявська С.Б., Божок Г.А., Легач Є.І., Бондаренко Т.П. Показники білкового, ліпідного і вуглеводного обмінів при гіпотиреозі та після комбінованої трансплантації щитоподібної і надниркових залоз // Клінічна ендокринологія та ендокринна хірургія. - 2005. - Т. 12, № 3. - С. 31-36. Здобувачем проведено: алотрансплантація НФ ЩЗ, дослідження рівнів тироксину, тиротропіну, альбуміну, холестерину і глюкози в плазмі крові тварин-реципієнтів, статистична обробка результатів.

3. Билявская С.Б., Божок Г.А., Легач Е.И., Бондаренко Т.П. Комбинированная трансплантация ткани щитовидной и надпочечниковых желез при послеоперационном гипотиреозе // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Серія: Біологія. - 2006. - Вип. 3, № 729. - С. 256-259. Здобувачем проведено: органотипове культивування, комбіноване культивування ЩЗ і НЗ, визначення рівнів тироксину, тиротропіну та біохімічних показників в плазмі крові тварин-реципієнтів, статистична обробка результатів.

4. Билявская С.Б., Бондаренко Т.П. Комбинированная трансплантация совместно культивированных тканей щитовидной железы и гипофиза при гипотиреозе // Експериментальна і клінічна медицина. - 2006. - № 2. - С. 50-53. Здобувачем проведено: планування дослідження, комбіноване культивування та сумісна трансплантація тканин ЩЗ і гіпофіза під капсулу нирки, визначення рівнів тироксину, тиротропіну, альбуміну, холестерину і глюкози в плазмі крові тварин-реципієнтів, статистична обробка результатів.

5. Легач Е.И., Билявская С.Б., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. Гормонопродуцирующий потенциал криоконсервированной органотипической культуры щитовидной железы при комбинированной ксенотрансплантации // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т. 17, № 1. - С. 86-92. Здобувачем проведено: комбіноване культивування, кріоконсервація та рекультивування тканин ЩЗ і НЗ, передтрансплантаційна обробка матеріалу, визначення рівнів гормонів в плазмі крові тварин-рецепієнтів, математичний аналіз результатів.

6. Легач Є.І., Божок Г.А., Білявська С.Б., Бондаренко Т.П. Ефект стимуляції тиротропіном на рівень тироксину в плазмі крові гіпотиреоїдних щурів після трансплантації щитовидної залози // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини. - 2007. - Т. 9, № 2 (ч. 2). - С. 63-67. Здобувачем проведено: серія експериментів in vitro, ТТГ-стимуляція in vivo, трансплантація під капсулу нирки, статистична обробка результатів.

7. Бондаренко Т.П., Білявська С.Б., Алабедалькарім Н.М., Божок Г.А. Функціональні властивості органної культури щитоподібної залози // Сучасні напрямки розвитку ендокринології: ІІІ Данилевські читання. - Харків, 2004. - С. 24-25. Здобувачем проведено: отримання ОКЩЗ щурів, визначення рівня Т4 в середовищі культивування, статистична обробка результатів.

8. Білявська С.Б., Бондаренко Т.П., Алабедалькарім Н.М., Божок Г.А. Подвійний ефект надниркових залоз на базальний та стимульований гормонопоез культури тиреоїдної тканини // Установчий зїзд Українського Товариства клітинної біології. Львів, 25-28 квіт. 2004 р.- Львів, 2004. - С. 151. Здобувачем проведено: органотипове культивування ЩЗ, визначення базального та стимульованого рівнів Т4 в середовищі культивування.

9. Билявская С.Б., Алабедалькарим Н.М., Божок Г.А. Регуляция тиреоидной секреции глюкокортикоидами и стимуляторами гормонопоэза in vitro // Укр. біохім. журн. - 2004. - Т. 76, № 4. - С. 125. Здобувачем проведено: отримання органотипових культур ендокринних тканин, інкубація ОКЩЗ в присутності глюкокортикоїдів та ін. модифікаторів гормонопоезу. Дослідження рівня тироксину в середовищі культивування.

10. Білявська С.Б., Божок Г.А., Легач Є.І., Бондаренко Т.П. Динаміка альбуміну у щурів після трансплантації органної культури щитоподібної залози // Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології: IV Данилевські читання. Харків, 24-25 лют. 2005 р.- Харків, 2005. - С. 23-24. Здобувачем проведено: серія експериментів in vitro, дослідження рівню альбуміну в плазмі крові тварин-реципієнтів.

11. Bilyavskaya S.B., Bozhok G.A., Legach E.I., Bondarenko T.P. Thyroxin serum level after combined transplantation of organ cultures of thyroid and adrenal glands // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т. 77, № 2 (спеціальний випуск). - С. 158. Здобувачем проведено: комбіноване культивування тканин ЩЗ щурів і НП, визначення рівня Т4 в плазмі крові тварин-реципієнтів, статистичний аналіз результатів.

12. Ustichenko V.D., Alabedalkarim N.M., Bilyavskaya S.B., Bondarenko T.P. CAMP-dependent regulation of hormonopoesis in newborn piglets cryopreserved organ cultures of thyroid and adrenal glands // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т. 77, № 2 (спеціальний випуск). - С. 81. Здобувачем проведено: отримання ОКЩЗ НП, визначення ЦАМФ-стимульованої секреції тироксину.

13. Білявська С.Б., Божок Г.А., Легач Є.І., Бондаренко Т.П. Вивчення показників вуглеводного, ліпідного та білкового обмінів за сумісного культивування та одночасної трансплантації органних культур щитовидної та надниркових залоз // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т.77, №. 5- С. 135. Здобувачем проведено: сумісне культивування тканин ЩЗ і НЗ, дослідження рівня біохімічних показників в плазмі крові експериментальних тварин.

14. Божок Г.А., Легач Є.І., Алабедалькарім Н.М., Білявська С.Б, Бородіна Н.П., Бондаренко Т.П. Функціональна активність кріоконсервованої органотипічної культури щитовидної залози при ксенотрансплантації // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 3. - С. 425-426. Здобувачем проведено: отримання ОКЩЗ НП та їх кріоконсервувіння, визначення рівнів Т4, ТТГ в плазмі крові гіпотиреоїдних щурів після трансплантацій.

15. Легач Є.І, Божок Г.А., Білявська С.Б. Комбінована трансплантація, як фактор поліпшення виживання кріоконсервованих тканинних трансплантатів // Клінічна хірургія. - 2006. - № 4-5. - С. 97-98. Здобувачем проведено: комбіноване культивування ендокринних тканин, кріоконсервування тканини ЩЗ НП.

16. Bilyavskaya S.B., Legach E.I., Bozhok G.A., Bondarenko T.P. Result of experimental hypothyroidism correction by combined transplantation of organ cultures // European J. of Medical Research. - 2007. - Vol. 12, suppl. IV. - P. 45. Здобувачем проведено: частина експерименту in vitro, визначення рівнів гормонів, статистичний аналіз результатів.

Білявська С.Б. Корекція експериментального гіпотиреозу шляхом комбінованої трансплантації органотипових культур. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. - Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2007.

Дисертація присвячена визначенню впливу комбінованих ауто-, ало- і ксенотрансплантацій нативних фрагментів та органотипових культур щитоподібних залоз (ОКЩЗ) щурів і новонароджених поросят із тканинами надниркових залоз і гіпофізу на перебіг післяопераційного гіпотиреозу у щурів.

Виявлено вірогідне зростання рівня тироксину в середовищі культивування під впливом дб-ЦАМФ, фрагментів надниркових залоз і гіпофізу, а також фізіологічних концентрацій кортикостерону і ТРГ. Крім того, після комбінованого культивування з тканинами надниркових залоз і гіпофізу ОКЩЗ зберігали фолікулярний каркас і достатню кількість життєздатних клітин. Відмічено максимальну ефективність алографтів нативних фрагментів щитоподібних залоз і комбінованих ксенографтів нативних фрагментів щитоподібних і надниркових залоз в корекції гіпотиреоїдного стану та супутніх метаболічних порушень. Отримано дані про позитивний вплив комбінованого культивування тканин щитоподібної, надниркових залоз і гіпофізу за умов їх комбінованої трансплантації на морфофункціональні характеристики основного графту і на тиреоїдний статус тварин-реципієнтів у цілому.

Ключові слова: гіпотиреоз, комбінована трансплантація, щитоподібна залоза, надниркові залози, гіпофіз, органотипові культури, комбіноване культивування, тироксин.

Билявская С.Б. Коррекция экспериментального гипотиреоза путем комбинированной трансплантации органотипических культур. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2007.

Диссертация посвящена изучению эффекта комбинированных ауто-, алло- и ксенотрансплантаций нативных фрагментов и органотипических культур щитовидных желез (ОКЩЖ) крыс и новорожденных поросят с тканями надпочечных желез и гипофиза на течение послеоперационного гипотиреоза у крыс.

С целью предварительной оценки функциональных параметров трансплантационного материала, на этапе предобработки проводилось исследование влияния специфических и неспецифических модификаторов гормонопоэза на секрецию тироксина ОКЩЖ крыс и новорожденных поросят в среду культивирования. В результате чего установлено, что под влиянием культивирования ОКЩЖ крыс в присутствии дб-ЦАМФ, фрагментов надпочечных желез и гипофиза, а также физиологических концентраций кортикостерона уровень тироксина в среде инкубации достоверно увеличивался. При инкубации ОКЩЖ новорожденных поросят с теми же модификаторами наблюдалась аналогичная картина, а при добавлении физиологических концентраций ТТГ стимулирующего эффекта не наблюдалось, тогда, как ТРГ в физиологической концентрации повышал уровень тироксина в среде инкубации. Выявлен нивелирующий эффект комбинированного культивирования ОКЩЖ новорожденных поросят и крыс с органотипическими культурами надпочечных железна Т4-гормонопоэз в присутствии дб-ЦАМФ. Эффект отмены действия стимулятора также присутствовал при комбинированном культивировании ОКЩЖ новорожденных поросят с тканью надпочечных желез и ТТГ. Кроме того, после комбинированного культивирования, как с тканью надпочечников, так и гипофиза ОКЩЖ новорожденных поросят сохраняла фолликулярный каркас и достаточное количество жизнеспособных клеток в культуре.

Для выяснения способности одиночных и комбинированных ауто-, алло- и ксенографтов компенсировать недостаточность тиреоидных гормонов и связанные с ней метаболические нарушения, на 30 сутки после трансплантации проводили исследования уровней тироксина, тиротропина и некоторых биохимических показателей крови (альбумина, холестерина, глюкозы). В группе тиреоидэктомированных животных отмечалось развитие стойкого гипотиреоза. Аллографты нативных фрагментов щитовидных желез и комбинированные ксенографты нативных фрагментов щитовидных и надпочечных желез оказались наиболее эффективными в коррекции гипотиреоидного состояния.

Известно, что механизм действия тиреоидных гормонов обуславливает многосторонние проявления нетиреоидной патологии. Показатели липидного, белкового и углеводного обменов у животных-реципиентов после трансплантаций закономерно восстанавливались с нормализацией уровня тироксина. Существенного изменения уровня альбумина в плазме крови гипотиреоидных крыс зафиксировано не было, однако наблюдалась тенденция к его повышению после комбинированной трансплантации щитовидной и надпочечных желез. Практически все трансплантаты оказались активными в нормализации уровня гликемии после углеводной нагрузки. Уровень холестерина в группах животных с комбинированной трансплантацией достигал контрольных значений, а в группах с трансплантации монографтов щитовидной железы - был выше нормы.

С целью изучения влияния гормонов надпочечных железна функциональную активность трансплантатов щитовидных желез in vivo, проводилось совместное культивирование данных тканей с последующей комбинированной трансплантацией. Установлено, что такой способ трансплантации способствовал нормализации тиреоидного статуса и показателей альбуминемии, гликемии и холестеринемии у животных-реципиентов в сравнительном аспекте с трансплантацией раздельно культивированного материала.

Комбинированная трансплантация ОКЩЖ с эксплантатами гипофиза после их совместного культивирования достоверно увеличивала секрецию тироксина основным графтом по отношению к тиреоидэктомированным животным и в сравнении с комбинированной трансплантацией раздельно культивированных тканей. В данной группе животных отмечено нормализацию уровней холестерина и глюкозы с углеводной нагрузкой.

Изучение динамики ТТГ в плазме крови животных-реципиентов показало, что в большинстве экспериментальных групп его уровень изменялся по принципу обратной зависимости от уровня тироксина, что подтверждает возможность функционирования трансплантата в пределах гипоталамо-тиреоидной системы реципиента.

Гистологический анализ трансплантационного материала, извлеченного на 30 сутки после операции показал, что максимальная сохранность трансплантата наблюдалась при ауто- и аллотрансплантациях нативного материала. Комбинированные ауто, алло- и ксенографты нативных фрагментов щитовидных и надпочечных желез характеризовались сохранением типичного фолликулярного строения и способности к регенерации тиреоидной паренхимы. Комбинированная трансплантация совместно культивированных тканей также способствовала сохранению гистоархитектоники щитовидной железы.

Следует отметить, что положительное влияние комбинированной трансплантации нативных эндокринных тканей щитовидной и надпочечных желез, а также комбинированной трансплантации кокультивированных тканей щитовидной железы и надпочечников, а также щитовидной железы и гипофиза на морфофункциональные характеристики основного графта и, в целом, на тиреоидный статус животных-реципиентов позволяет предположить клиническую эффективность использования данного метода для лечения первичного гипотиреоза.

На основании полученных результатов, комбинированное культивирование 2 видов эндокринных тканей можно считать одним из эффективных способов предобработки трансплантационного материала с целью улучшения его функциональных параметров.

Ключевые слова: гипотиреоз, комбинированная трансплантация, щитовидная железа, надпочечные железы, гипофиз, органотипические культуры, комбинированное культивирование, тироксин.

Bilyavska S.B. Correction of experimental hypothyroidism by combined transplantation of organ cultures. - Manuscript.

The thesis for obtaining the degree of candidate (Ph.D.) of biological science by speciality 03.00.13 - physiology of human & animals. - V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2007.

The dissertation is devoted to study the influence of combined auto-, allo- and xenotransplantation of native and cultured thyroid tissue with adrenal and pituitary tissues on the rat experimental hypothyroidism.

The reliable increase of thyroxin level at the influence of db-CAMP, adrenal and pituitary tissues, corticosteron and TRH in physiological concentration was established. The thyroid organ culture saved the follicular structures and cell viability after the combine cultured with adrenal and pituitary tissues. The maximum effect of thyroid allografts of native fragments and combined xenografts of thyroid and adrenal glands on the hypothyroidism and metabolic correction was noted. The data about positive impact of combined cultivation of thyroid, adrenal and pituitary tissues under combined transplantation on the morfofunctional characteristics of main graft and whole recipients thyroid status were obtained.

Key words: hypothyroidism, combined transplantation, thyroid, adrenal glands, pituitary, organ cultures, combined cultivation, thyroxin.