Способ получения инсерционных мутантов по гену hoc, кодирующему основной антиген фага на модели бактериофага Т4. Характерные свойства мутантов, полученных в результате этой методики. Получение гомогенного препарата с помощью осаждения полиэтиленгликолем.
Аннотация к работе
Геномы таких бактериофагов не должны содержать генов, участвующих в развитии патогенеза у бактерий. Бактериофаг Т4 и родственные ему бактериофаги, содержащие в составе своей ДНК глюкозилированный гидроксиметилцитозин вместо цитозина, обладают такими свойствами [4, 5]. В ответ на иммунизацию животных бактериофагом Т4 синтезируется нормальный спектр специфических антител и он имеет уже значительный уровень на самых ранних стадиях иммунизации [9], более того антитела к фагу Т4 часто присутствуют в нормальной сыворотке животных. Бактериофаги, использованные в работе с системой инсерции и сегрегации и при анализе полученных мутантов по гену hoc перечислены в таблице 2. инсарционный мутант ген бактериофаг Схема конструирования бактериофага Т4 S8, содержащего ген аминогликозид 3"-фосфотрансферазы в структурной части orf 376 ак. orf 92 - дистальная к гену hoc рамка трансляции, orf 226 - проксимальная к гену hoc рамка трансляции (inh), orf376 - hoc, SUPF - ген супрессорной ТРНК, Amp - ген резистентности к ампициллину, Km - ген резистентности к канамицину, PNX11K - плазмида, использованная для рекомбинацииВ данной работе показана возможность внедрения протяженной последовательности ДНК в ген hoc бактериофага Т4, исследована генетическая стабильность подобных конструкций в периодическом выращивании более чем в 50 поколениях. Показано, что инсерционные мутанты по гену hoc обладают сниженной антигенность за счет потери наружнего белка капсида фага, продукта этого гена, но обладают высокими биотехнологическими показателями при выращивании, при контроле чистоты препаратов с помощью трансмиссионной электронной микроскопии и являются перспективными штаммами фага Т4 для их включения в антибактериальные препараты, для применения в медицине или ветеринарии. На примере минимального загрязнения ПЭГ600 в процессе очистки фагов из фагового лизата бактерий показана возможность контроля загрязнений.
Вывод
1. В данной работе показана возможность внедрения протяженной последовательности ДНК в ген hoc бактериофага Т4, исследована генетическая стабильность подобных конструкций в периодическом выращивании более чем в 50 поколениях.
2. Показано, что инсерционные мутанты по гену hoc обладают сниженной антигенность за счет потери наружнего белка капсида фага, продукта этого гена, но обладают высокими биотехнологическими показателями при выращивании, при контроле чистоты препаратов с помощью трансмиссионной электронной микроскопии и являются перспективными штаммами фага Т4 для их включения в антибактериальные препараты, для применения в медицине или ветеринарии.
3. Успешно опробован метод исследования белков препаратов бактериофагов Т4-типа с помощью масс-спектрометрии. На примере минимального загрязнения ПЭГ600 в процессе очистки фагов из фагового лизата бактерий показана возможность контроля загрязнений.
4. Суммируя: предложен метод получения бактериофагов со сниженной антигенность из различных изолятов бактериофагов, родственных Т4, широко применяемых в фаговой терапии человека и сельскохозяйственных животных.
Авторы благодарят К. Крузера и И. Мессинга за штаммы бактерий, фагов и препараты плазмид, любезно предоставленные для выполнения данного исследования. Авторы благодарят В.И. Таняшина за плодотворное обсуждение работы.
Список литературы
1. Krylov V., Shaburova O., Pleteneva E., et al. Selection of phages and conditions for the safe phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections //Virol Sin. - 2015. - Т. 30 - №1. - С. 33-44.
2. Abedon ST, Garcia P, Mullany P, Aminov R. Editorial: Phage Therapy: Past, Present and Future // Front Microbiol. - 2017. - Т.15. - №8 - С. 981.
3. Krylov V.N. Bacteriophages of Pseudomonas aeruginosa: longterm prospects for use in phage therapy //Adv Virus Res. - 2014. - Т.88. - С. 227-78.
4. Taniashin V.I., Zimin A.A., Shliapnikov M.G. et. al. Transduction of plasmidantibiotic resistance determinants with pseudo-T-even bacteriophages //Genetika. -2003. - Т. 39. - №7 - С. 914-26.
5. Tanyashin V.I., Zimin A.A., Boronin A.M. The cotransduction of PET system plasmids by mutants of T4 and RB43 bacteriophages //Microbiology (Mikrobiologiya). - 2003. - Т.72. - №6. - С. 694-700.
6. Miller ES, Kutter E, Mosig G, Arisaka F, Kunisawa T, Ruger W. Bacteriophage T4 genome // Microbiol Mol Biol Rev. - 2003. - Т.67. - №1. - С. 86-156.
7. Franklin NC. Serological study of tail structure and function in coliphages T2 and T4 //Virology. - 1961. - Т.14. - С. 417-29.
8. Watanabe I. The effect of ultraviolet light on the production of bacterial virus protein //J Gen Physiol. - 1957. - Т.20. - №40 (4). - С. 521-31.
9. Jerne NK. The presence in normal serum of specific antibody against bacteriophage T4 and its increase during the earliest stages of immunization //J. Immunol. - 1956 - Т.76. - №3. - С. 209-16.
10. Barry GT. A study of the antigenicity of T3 and T4 coli-dysentery bacteriophages during the vegetative stage of development //J Exp Med. - 1954. - Т.1. - №100 (2) - С. 163-80.
11. Leiman PG, Kanamaru S, Mesyanzhinov VV, et al. Structure and morphogenesis of bacteriophage T4 //Cell Mol Life Sci. - 2003. - Т.60. - №11. - С. 2356-2370.
12. Ishii T., Yanagida M. Molecular organization of the shell of the T-even bacteriophage head //J. Mol. Biol., - 1975. - Т.97. - №4. - С. 655-660.
13. Ishii T., Yanagida M., The two dispensable structural proteins (soc and hoc) of the T4 phage capsid; their purification and properties, isolation and characterization of the defective mutants, and their binding with the defective heads in vitro //J. Mol. Biol. - 1977. - Т.109. - №4. - С. 487-514.
14. Ishii T., Yamaguchi Y., Yanagida M. Binding of the structural protein soc to the head shell of bacteriophage T4 //J. Mol. Biol., - 1978. - Т.120. - №4. - С. 533-544.
15. Yamaguchi Y., Yanagida M., Head shell protein hoc alters the surface charge of bacteriophage T4. Composite slab gel electrophoresis of phage T4 and related particles //J. Mol. Biol. - 1980. - 141. - №2. - С. 175-193.
16. Childs JD. Effect of hoc protein on the electrophoretic mobility of intact bacteriophage T4D particles in polyacrylamide gel electrophoresis //J Mol Biol. - 1980. - Т. 141. - №2. - С. 163-73.
17. Yanagida M, Suzuki Y, Toda T. Molecular organization of the head of bacteriophage Teven: underlying design principles //Adv Biophys. - 1984. - №17. - С. 97-146.
18. Chibani-Chennoufi S., Sidoti J., Bruttin A. et al. Isolation of Escherichia coli bacteriophages from the stool of pediatric diarrhea patients in Bangladesh //Journal of bacteriology. - 2004. - Т. 186. - №. 24. - С. 8287-8294.
19. Tetart F., Desplats C., Kutateladze M. et al. Phylogeny of the major head and tail genes of the wide-ranging T4-type bacteriophages //Journal of Bacteriology. - 2001. - Т. 183. - №. 1. - С. 358-366.
20. Sarker SA, MCCALLIN S, Barretto C et al. Oral T4-like phage cocktail application to healthy adult volunteers from Bangladesh //Virology. - 2012. - Т. 434. - №. 2. - С. 222-232.
21. Kaliman AV, Khasanova MA, Kryukov VM, Tanyashin VI, Bayev AA. The nucleotide sequence of the region of bacteriophage T4 inh(lip) - hoc genes // Nucleic Acids Res. - 1990. - Т.25. - №18 (14). - С. 4277.
22. Vieira J, Messing J. The PUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers //Gene. - 1982. - Т.19. - №3. - С. 259-68.
23. Appleyard, RK et al. (1956) Mutation to extended host range and the occurrence of phenotypic mixing in the temperate coliphage lambda // Virology - №2. - С. 565-74.
24. Appleyard, RK (1954) Segregation of New Lysogenic Types during Growth of a Doubly Lysogenic Strain Derived from Escherichia Coli K12 //Genetics. - №39. - С. 440-52.
25. Berlyn, M.K.B. (1996). In F.C. Niedhardt et al. (Ed.), Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, (2nd ed.), Vol. 2, (pp. 1715-1902).
26. Selick HE, Kreuzer KN, Alberts BM. The bacteriophage T4 insertion/substitution vector system. A method for introducing site-specific mutations into the viruschromosome //J Biol Chem. - 1988. - Т. 263. - №23. - С. 11336-47.
27. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
28. De Bruyne K., Slabbinck B., Waegeman W., et al. Bacterial species identification from MALDI-TOF mass spectra through data analysis and machine learning //Systematic Appl. Microbiol. - 2011. - Т.34. - №1 - С. 20-29.
29. Dabrowska K, Switala-Jelen K, Opolski A, Gorski A. Possible association between phages, Hoc protein, and the immune system //Arch Virol. -2006. - Т.151. - №2. - С. 209-215.