Виды вставок при конструировании рекомбинантных молекул ДНК, лигирование вектора со вставкой. Инфекция, трансфекция и клонирование. Скрининг клонированных популяций рекомбинантных молекул. Виды ДНК-библиотек, стратегии клонирования генов и кДНК.
Аннотация к работе
При конструировании рекомбинантных молекул обычно используют сложные смеси потенциальных вставок, и в результате образуется целый набор клонов, из которого путем скрининга и отбора получают нужные рекомбинантные молекулы. При расщеплении ДНК млекопитающих ферментами, которые разрезают молекулу по сайтам узнавания длиной шесть пар нуклеотидов, образуется примерно 7*105 уникальных фрагментов, а ферментом, сайт узнавания которого составляет четыре пары нуклеотидов, - 12*106 фрагментов. Если имеется гомологичная ДНК или препарат комплементарной РНК, которые можно использовать в качестве зонда при гибридизации, то интересующий нас фрагмент можно обнаружить при отжиге зонда с фрагментами после их денатурации. В этом случае к З"-концу первой цепи ДНК с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы присоединяли poly и использовали о%о-праймер для синтеза второй цепи. Немного модифицировав этот метод, можно получить плазмиды, содержащие молекулы КДНК в форме, способной экспрессироваться в клетках эукариот.