Конкурентне зв"язування біологічно активних речовин з полінуклеотидними матрицями - Автореферат

У дисертаційній роботі запропоновано новий комплексний підхід до спектрофотометричних досліджень конкурентного звязування двох біологічно активних речовин (лігандів) з нуклеїновими кислотами. У роботі пропонується нова методика дослідження процесів конкурентного звязування, у якій сполучення спектрофотометричних вимірів і розрахункових методів дозволяють одержувати інформацію про спектральні, термодинамічні і концентраційні характеристики усіх комплексів, що утворюються, у потрійних системах БАР1 - НК - БАР2, а також оцінювати вплив кожного з біологічно активних компонентів на звязування з НК інших не менш важливих лігандів. При цьому БАР з відомими типами взаємодії з ДНК (актиноциновое похідне Астіі, бромистий этидий чи Хоехст 33258) використовуються як забарвлені мітки для одержання параметрів і типу звязування з НК лігандів, що не мають спектрів поглинання у видимій області (кофеїн (CAF), теофілін (Tph), біологічно активні нуклеозиди (NUC)). Розглянуті модельні системи Астіі - ДНК - бромистий етидій і Астіі - ДНК - Хоехст 33258 з метою одержання параметрів звязування БАР з ДНК для випадку, коли оба БАР (один із яких утворює кілька типів комплексів на ДНК) поглинають у видимій області спектру, розроблена методика аналізу звязування в таких системах. Запропонована нами методика аналізу конкурентного звязування в потрійних системах БАР1 - НК - БАР2 дозволяє враховувати вплив одного БАР на звязування другого з НК, визначати тип звязування БАР з НК, а також визначати параметри звязування БАР з НК у випадку, коли він не поглинає ні у видимій, ні в УФ областях спектра чи має слабку спорідненість до НК.Для аналізу процесів комплексоутворення в потрійній системі БАР1 - ДНК - БАР2 розглянуто моделі звязування, що по-різному описують звязування цих лігандів з ДНК. Описані нижче моделі використовуються у програмах оптимізації для розрахунку параметрів звязування БАР з НК. Модель 2 розглядає звязування БАР2 із ДНК у присутності БАР1 з урахуванням утворення двох типів комплексів БАР2 із ДНК (ліганда, що має сусідів і ліганда, що не має сусідів на матриці) з різними молярними коефіцієнтами екстинкції і з урахуванням кооперативного звязування БАР2 з фактором кооперативності щ на місцях звязування n2 з константою звязування K2. При обчисленні оптимальних параметрів звязування для сумішей Tph - ДНК - ЕБ по Моделі 1, у якій величина місця звязування Tph із ДНК варіювалася, було знайдено що n1=1 щонайкраще задовольняє експериментальним даним. Оскільки ЕБ при звязуванні з ДНК може утворювати з ДНК два типи комплексів з різними молярними коефіцієнтами екстинкції, для тих же нуклеозидів і використовуючи ту ж базу даних було проведено розрахунки параметрів звязування по Моделі 2 при фіксованій величині місця звязування n1=1.Для цього була розроблена нова методика аналізу спектрів поглинання в потрійних системах БАР1 - НК - БАР2. Розроблена методика аналізу конкурентного звязування може бути використана для одержання параметрів комплексоутворення з нуклеїновими кислотами БАР, що не поглинають ні у видимій, ні в УФ областях спектру; для визначення типу звязування БАР з поліелектролітною матрицею; для врахунку впливу одної з конкуруючих БАР на звязування другої з нуклеїновою кислотою та ефектів сінергизму. Показано, що розроблений нами підхід є ефективним у випадку, коли конкуруючі БАР звязуються з ДНК різними способами та у випадку мультимодального звязування одної з БАР. Показано, що БАР, що мають слабку спорідненість до НК (наприклад, теофілін і кофеїн) впливають на звязування інших лігандів з НК тільки при великих концентраціях БАР. Показано, що теофілін є більш активним, чим кофеїн, акцептором ароматичних молекул у розчині, у той час, як константи звязування цих двох БАР з ДНК практично збігаються.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. У ході виконання роботи було вивчено фізичні механізми конкурентного звязування різних комбінацій біологічно активних речовин з НК. Для цього була розроблена нова методика аналізу спектрів поглинання в потрійних системах БАР1 - НК - БАР2. Показано ефективність даної методики незалежно від області поглинання лігандів. Розроблена методика аналізу конкурентного звязування може бути використана для одержання параметрів комплексоутворення з нуклеїновими кислотами БАР, що не поглинають ні у видимій, ні в УФ областях спектру; для визначення типу звязування БАР з поліелектролітною матрицею; для врахунку впливу одної з конкуруючих БАР на звязування другої з нуклеїновою кислотою та ефектів сінергизму. Показано, що розроблений нами підхід є ефективним у випадку, коли конкуруючі БАР звязуються з ДНК різними способами та у випадку мультимодального звязування одної з БАР. Отримані у роботі дані можуть бути використані для аналіз взаємодії біологічно активних речовин з нуклеїновими кислотами та дослідження впливу конкуруючих речовин на біологічну активність препаратів ген-спрямованої дії.

2. Показано, що БАР, що мають слабку спорідненість до НК (наприклад, теофілін і кофеїн) впливають на звязування інших лігандів з НК тільки при великих концентраціях БАР. При цьому їхній вплив виявляється як за рахунок взаємодії БАР у розчині так і за рахунок безпосередньої конкуренції за місця звязування з НК. Показано, що теофілін є більш активним, чим кофеїн, акцептором ароматичних молекул у розчині, у той час, як константи звязування цих двох БАР з ДНК практично збігаються.

3. Визначено, що в деяких системах вплив конкуруючих БАВ зводиться в основному до конкуренції за місця звязування на НК і практично відсутня взаємодія БАР у розчині. Також показано, що конкуруюча дія може виявлятися навіть у випадку, коли механізми взаємодії БАР з НК різні. Аналіз таких взаємодій проведений на прикладі ряду систем біологічно активний нуклеозид - ДНК - бромистий етидій. Отримано константи звязування з ДНК біологічно активних нуклеозидів, азо-похідних цитидину. Показано, що ці БАР взаємодіють з ДНК у жолобі і не мають АТ- чи Гц-специфічністі звязування. Показано, що на відміну від теофіліну і кофеїну конкурентна дія нуклеозидів виявляється при їх концентраціях, приблизно рівних концентрації в суміші бромистого етидія.

4. Показано, що структура і конформація матриці нуклеїнової кислоти відіграє істотну роль при взаємодії з нею БАР. Наприклад, показано, що актиноциновое похідне Астіі звязується з одно- та двоспіральною полірибоцитидиловою кислотою тільки в жолобі з утворенням мономерно звязаних і агрегованих комплексів. З ДНК ж Астіі додатково утворює комплекс по типу інтеркаляції. Також показано, що кофеїн звязується з односпіральною poly(C) і практично не взаємодіє з двуспіральною.

5. Вперше отримано, що при звязуванні 6-азацитозіну рибофуранозіду з ДНК у присутності бромистого етидія константа утворення комплексу 6-азацитозіну рибофуранозіду з ДНК значно вище, ніж при його взаємодії з ДНК під час відсутності етидіуму броміду, тобто спостерігається ефект сінергізму (збільшення активності БАР у суміші).

6. На прикладі модельних систем Астіі - ДНК - бромистий етидій і Астіі - ДНК - Хоехст 33258 розроблена методика аналізу спектрів складних потрійних систем, у яких обоє БАР поглинають в одній чи близьких областях спектру. Розраховано параметри звязування Астіі з тимусною ДНК у присутності конкуруючих БАР різного типу (інтеркалятора бромистого етидія і Хоехста 33258, що звязується в малому жолобі ДНК). Показано, що Астіі звязується з тимусною ДНК мультимодально і за допомогою конкуруючих БАР можна змінювати співвідношення різних типів комплексів Астіі з ДНК і в такий спосіб впливати на його активність.

1. Круглова Е.Б., Ермак Е.Л. Исследование конкурентного связывания двух лигандов: актиноцинового антибиотика и кофеина с ДНК // Вестник Харьковского университета. Биофизический вестник. - 2003. - Вып.1(12) - С.64 - 69.

2. Круглова Е.Б., Ермак Е.Л. Конкурентное связывание двух лигандов: актиноцинового производного и кофеина с полирибоцитидиловой кислотой в разных конформационных состояниях // Вестник Харьковского университета. Биофизический вестник. - 2004. - Вып.1-2(14) - С.32-37.

3. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Влияние конкурирующих лигандов разного типа на связывание актиноцинового производного ACTII с ДНК // «Вестник СЕВГТУ» (Физика и математика). - 2005. - т.70. - С. 118 - 126.

4. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Связывание теофиллина с тимусной ДНК в присутствии конкурирующих лигандов // Биофизический вестник. - 2007. - Вып.2 (19). - С. 13 - 19.

5. Iermak Ie.L., Kruglova O.B., Palchykovska L.H., Alexeeva I.V. Spectrophotometrical study of mechanisms of binding of cytidine analogues and ethidium bromide with DNA // Biopolymers and cell. - 2007. - v. 23. - № 6. - Р. 529 - 536.

6. Ermak E.L., Kruglova E.B. Spectrophotometric investigation of competitive binding of two ligands: actinocin antibiotic and caffeine to DNA // Proc. of the XVI International School-Seminar Spectroscopy of Molecules and Crystals XVI ISSSMC. - Sevastopol, Ukraine. - 2003. - P.295.

7. Ermak E.L., Kruglova E.B. Thermodynamic characteristics of interaction in three-component systems: DNA-ligand-caffeine in aqueous solutions // Abstr. Of The 2nd International Conf. Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. - Kyiv, Ukraine. - 2003. - P.171.

8. Ermak E.L., Kruglova E.B., Maleev V. Ya. investigation of competitive binding of biologically active ligands to nucleic acids // Тези 1 Української наукової конференції Проблеми біологічної і медичної фізики ПБМФ - 2004. - Харків, Україна. - 2004. - С. 54.

9. Ermak E.L., Kruglova E.B. investigation of competitive binding of biologically active ligands with calf thymus DNA in aqueous solution // 3rd International Conference Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. - Kyiv, Ukraine. - 2005. - P.191.

10. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. связывание актиноцинового производного ACTII с ДНК в присутствии бромистого этидиума и Хоехста 33258 // Материалы Всеукраинской научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики “Физика. Биофизика - 2005”.Севастополь, Украина. - 2005. - С. 62.

11. Ermak E.L., Kruglova E.B. Binding of the new actinicine derivative ACTII to calf thymus DNA in the presence of competing ligands // Proceedings of the 8th Romanian Biophysics Conference with international participation "Advanced Biomaterials and Biophysical Techniques. Iasi, Romania. - 2005. - P.126-127.

12. Ermak E.L., Kruglova E.B. New aspects of ethidium bromide interaction with calf thymus DNA // Пята Харківська конференція молодих науковців. Радіофізика та НВЧ електроніка. - Харків, Україна. - 2005. - С.103.

13. Iermak Ie.L., Kruglova O.B., Bolbukh T.V. binding modes of ethidium bromide to calf thymus DNA // Proceedings of the Workshop on the Structure and Function of Biomolecules II 2006. Bedlewo, Poland - 2006. - P. 68.

14. Iermak Ie.L., Kruglova O.B. Study of actinocine derivative and ethidium bromide competitive binding to calf thymus DNA // VII Kharkiv Young Scientist Conference on “Radiophysics and Electronics”. - Kharkiv, Ukraine. - 2007. - P.39.

15. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Сравнительный анализ взаимодействия взаимодействия теофиллина и кофеина с тимусной ДНК в присутствии конкурирующих лигандов // IV Всеукраинская научно-техническая конференция актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ - 2008”. Севастополь, Украина. - 2008. - С.152 - 153.

16. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Методика анализа конкурентного связывания двух лигандов с нуклеиновыми кислотами // 1-а Всеукраїнська наукова конференція молодих вчених Фізика низьких температур КМВ-ФНТ-2008. - Харків, Україна. - 2008. - С.102.

17. Iermak Ie.L., Kruglova O.B. Study of ethidium bromide binding to calf thymus DNA in presence of competing ligands in aqueous solution // 4th International Conference Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. - Kyiv, Ukraine. - 2008. - P.206.

Размещено на .ru