Коренеспецифічна та світлозалежна експресія химерних генів в бактеріальних та рослинних клітинах. Клонування фрагментів дезоксирибонуклеїнової кислоти. Здатність рослин до акумуляції іонів металів в клітинах органів з експресією гена металотіонеїну.
Аннотация к работе
Це повязано насамперед з можливістю за допомогою генно-інженерних технологій одержання нових сортів рослин з високою продуктивністю, ознаками стійкості до шкідників, гербіцидів, хвороб та несприятливих умов навколишнього середовища, рослин з підвищеною кількістю білків, ліпідів, крохмалю, цукрів та здатністю зберігатися більш тривалий час без погіршення якості (Кучук, 1997, Zhang, 2004); рослин, що здатні синтезувати, глікозилювати і збирати білки ссавців, напрацьовуючи їх в величезній кількості при низькій собівартості (Goddijn et al.,1995). Сконструйовані вектори, що мають клоновані нами промоторні послідовності, які забезпечують коренеспецифічну та світлозалежну експресію химерних генів, є перспективними для введення чужорідних генів в рослини з метою надання їм цінних сільськогосподарських ознак і для біотехнологічних цілей, особливо в тих випадках, коли необхідно експресувати ген в певному органі рослини. Результати дисертаційної роботи доповідались на вітчизняних та міжнародних зїздах та конференціях: ІІ-му (1993) та ІІІ-му (1995) Симпозіумах “Нові методи біотехнології рослин” (Пущино, Росія), на 4-му Міжнародному симпозіумі „In Situ and On Site Phytoremediation” (Нью-Орлеан, США,1997), на 9-му міжнародному конгресі „Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century” (Ієрусалім, Ізраїль, 1998), на Міжнародному симпозіумі “Intracellular Signalling in Plant and Animal System (ISPAS)” (Київ, Україна, 2001), на 1-му зїзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004) та на наукових конференціях і семінарах Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України. Аналіз експресії гена npt-II в трансформованих протопластах тютюну проводили за методикою запропонованою в керівництві Дрейпера (Дрейпер із співав.,1991), а активність продукту cat-гена в трансформантах визначали за модифікованим методом Гормана (Gorman and Moffet., 1982). Позитивним контролем слугували рослини, що містили плазміду PLGV23neo, в якій ген npt-II знаходиться під контролем nos промотора.За допомогою рестриктаз BGLII і ECORI одержано фрагменти ядерної ДНК клітин тютюну для відбору з них регуляторних (промоторних) ділянок генів. Відбір промоторних послідовностей проведено за допомогою бактеріальних клітин, трансформованих векторними плазмідами, що містили маркерний ген неоміцинфосфотрансферази під різними фрагментами ядерної ДНК, вбудованими замість власного промотору маркерного гена. На основі плазміди PUC19 сконструйовано вектор PUC23t, який містить досліджувану промоторну послідовність RPS12, сайт рестрикції BAMHI для вбудовування структурних генів та термінатор транскрипції гена нопалінсинтази Ti-плазміди.
Вывод
1. За допомогою рестриктаз BGLII і ECORI одержано фрагменти ядерної ДНК клітин тютюну для відбору з них регуляторних (промоторних) ділянок генів. Відбір промоторних послідовностей проведено за допомогою бактеріальних клітин, трансформованих векторними плазмідами, що містили маркерний ген неоміцинфосфотрансферази під різними фрагментами ядерної ДНК, вбудованими замість власного промотору маркерного гена.
2. У результаті скринінгу на середовищі з канаміцином відібрано послідовність з промоторною активністю розміром 470 п.о. Фрагмент сиквеновано, встановлено його гомологію з 3?-промоторною послідовністю хлоропластного гена рибосомного білка S12 тютюну і визначені його регуляторні елементи.
3. На основі плазміди PUC19 сконструйовано вектор PUC23t, який містить досліджувану промоторну послідовність RPS12, сайт рестрикції BAMHI для вбудовування структурних генів та термінатор транскрипції гена нопалінсинтази Ti-плазміди.
4. За допомогою вектора PUC23t з введеними генами npt-II та cat під контролем промоторної послідовності RPS12, отримані трансгенні рослини N. tabacum, у яких виявлена коренеспецифічна експресія маркерних генів.
5. За допомогою полімеразної ланцюгової реакції ампліфіковано промотор гена томату RBCS-3A, проклоновано в векторі PBLUESCRIPT SK( /-), сиквеновано та охарактеризовано його регуляторні ділянки.
6. На основі плазміди PUCT одержано експресуючий вектор з касетою RBCS3A-cat-term, який в результаті Agrobacterium-опосередкованої трансформації перенесено в рослини тютюну. Показана світлоіндукуєма та органоспецифічна експресія cat-гена в трансформованих рослинах. За допомогою делеційного аналізу промотору RBCS-3A показана наявність в ньому елементів позитивної та негативної регуляції.
7. За допомогою векторних конструкцій PUC23t та PDL1 з введеним в них геном металотіонеїну, одержані трансгенні рослини тютюну з органоспецифічною експресією гена металотіонеїна визначеною по показнику накопичення в них йонів Cu2 та Cd2 з живильного середовища.
Список литературы
1. N.V.Grzhelyak, A.P.Galkin, L.V.Gening, T.V.Medvedeva, L.G.Lioshina, O.V.Bulko, K.G.Gazaryan Chloroplast "cryptic" promoter can be activated upon their transfer to plant nuclear genome // Биополимеры и клетка.- 1996.-т.12.-№6.-С.87-93.
2. A.P.Galkin, O.V.Bulko, L.G.Leoshina, A.N.Vasiliev, T.V.Medvedeva Cleanup of contaminated lands from heavy metals using transgenic plants // Proc. 4th Itern. Sity and on Site Phytoremeditation Symp.. New-Orlean, USA.- 1997.-V.3.-Р.325-329.
3. Л.Г.Льошина, Т.В.Медведєва, О.В.Булко, А.П.Галкін Клонування та дослідження промоторних послідовностей, що скеровують органоспецифічну та світлозалежну регуляцію химерних генів в трансформованих рослинах // Збірник праць “Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть”.- 2001.-т.1- С.635-641.
4. Л.Г.Льошина, Т.В.Медвєдєва, О.В.Булко, А.П.Галкин, В.П.Кухар. Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів в трансгенних рослинах: одержання та клонування корене- бульбо- та листспецифічних промоторів // Біополімери та клітина.- 2003.- т.19.-.№2.- С.169-178.
5. А.П.Галкин, Т.В.Медведева, Л.Г.Лешина, О.В.Булко, В.П.Кухар. Трансгенные растения: за и против // Биополимеры и клетка.- 2003.-т.19.-№4.-С.317-327.
6. А.П.Галкин, Л.Г.Лешина, Т.В.Медведева, О.В.Булко, В.П.Кухар Регуляторные области промоторов генов растений и белки-регуляторы промоторной активности// Биополимеры и клетка.- 2004.- т.20.-.№5.- С.363-379.
7. A.P.Galkin, L.G.Lioshina, O.V.Bulko Cloning of the 3 organ-specific promoters: root-, tuber- and leafspecific // Abstr. of the IX International Congress on Plant Tissue and Cell Culture (14-19 June 1998).-Jerusalem (Israel).-1998.-Р.142.
8. A.P.Galkin, P.G.Kovalenko, L.G.Lioshina, O.V.Bulko, D.M.Fedoryak Obtaining of transgenic plants of tobacco and potato with organ-specific expression of hymeric metallothionein // Interactions and Intersection in Plant Signaling Pathways (February 8-14, 1999).-Idaho(USA).-1999.-Р.57.
9. L.G.Lioshina, T.V.Medvedeva, O.V.Bulko, A.P.Galkin About participation of eucariotic cys and trans factors in the regulation of procariotic (cloroplastic) promoters activity // International Symposium “Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems (ISPAS)”, (September 9-14, 2001).- Kiev (Ukraine).- 2001.-С.75.
10. L.Lioshina, O.Bulko The induction of extensine and metallothioneine synthesis in the cells of genetically transformed plants // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (April 25-28, 2004).-Lviv (Ukraine).- 2004.- p.106.