Дослідження та ідентифікація нових білків-партнерів кінази рибосомного білка S6 із використанням методу двогібридної дріжджової системи. Встановлення субклітинної локалізації S6K1-білкових комплексів та аналіз зв"язку виявлених взаємодій у клітині.
Аннотация к работе
Встановлено, що незважаючи на високий ступінь гомології (85%) первинних структур кіназ впродовж каталітичних доменів і відповідно високу специфічність до спільного субстрату - S6 рибосомного білка існують суттєві відмінності у регуляції та функціонуванні кіназ у клітині. Встановлено провідну роль S6K1 у регуляції біосинтезу білка індукованого ростовими факторам, гормонами та іншими мітогенними стимулами шляхом фосфорилювання рибосомного білка S6 і, як наслідок, активації ініціації трансляції МРНК, що кодують компоненти апарату біосинтезу білка - рибосомні білки, фактори елонгації білкового синтезу. На сьогодні ідентифіковано цілий ряд специфічних для S6K субстратів - проапоптичний мітохондріальний білок BAD, фактор транскрипції CREM, фактор ініціації трансляції EIF-4B, однак найбільш дослідженим є S6 рибосомний білок і лише для нього доведено існування опосередкованого S6K1 та S6K2 фосфорилювання in vivo. білок рибосомний двогібридний субклітинний Ампліфікація цього гена корелює із зростанням експресії даної форми S6 кінази у цих клітинах як на рівні МРНК, так i білка. Метою дослідження було ідентифікувати нові білки-партнери кінази рибосомного білка S6 із використанням методу двогібридної дріжджової системи та проаналізувати функціональний звязок виявлених взаємодій у клітині.Для одержання мутантної форми КОА-синтази, що мала точкову мутацію, використовували набір для мутагенезу “Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit” фірми ”Stratagene”, США. Імунопреципітацію рекомбінантних форм кіназ, злитих із ЕЕ-таг епітопом та рекомбінантних форм КОА-синтази злитих з Мус-таг епітопом здійснювали, інкубуючи лізати клітин із анти-ЕЕ-таг та анти-Мус-таг моноклональними антитілами і білок-G-сефарозою (“Amersham”, Велика Британія). Для визначення активності повнорозмірної форми КОА-синтази відповідну КДНК було клоновано в рамці з нуклеотидною послідовністю Myc-таг епітопу в вектор PCDNA3.1 та експресовано у клітинах НЕК293. Визначення нуклеотидної послідовності КДНК, що кодує КОА-синтазу, дало змогу проаналізувати експресію КОА-синтази в різних тканинах ссавців. Було створено такі мутантні форми КОА-синтази: делетовану з N-кінця КОА-синтазу, що не містила перших 175 амінокислот (DN КОА-синтаза); делетовану з С-кінця КОА-синтазу, що не містила останніх 214 амінокислот (DC КОА-синтаза).Встановлено, що мітохондріальна локалізація КОА-синтази забезпечується гідрофобним N-кінцевим доменом КОА-синтази. Доведено, що взаємодія між S6K1 та КОА-синтазою не впливає на активність S6K1 та КОА-синтази. Особистий внесок здобувача - проведено двогібридне скринування КДНК бібліотеки ембріонів миші з використанням S6K1 як “байт”, розроблено методику кількісного виміру росту дріжджових клонів, специфічність отриманих клонів перевірено методом статевого злиття. Особистий внесок здобувача - автором клоновано КДНК КОА-синтази в бактеріальні та еукаріотичні експресійні вектори, проведено біоінформаційний аналіз первинної структури отриманого клону, проведено Нозерн-та Вестерн-блот аналіз рівня експресії МРНК КОА-синтази в різних тканинах ссавців, виявлено наявність у продукті КДНК двох активностей. Особистий внесок здобувача - отримано рекомбінантні плазміди для вивчення субклітинної локалізації КОА-синтази, проведено імунофлуоресцентний аналіз субклітинної локалізації КОА-синтази, проведено субклітинне фракціонування та аналіз фракцій лізатів клітин.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Вывод
У дисертаційній роботі методом двогібридної системи дріжджів ідентифіковано та досліджено S6K звязувальний білок - КОА-синтазу. Вперше виявлено звязок ензимів сигнальних шляхів клітини з ензимами біогенезу КОА.
1. Методом двогібридної системи дріжджів шляхом аналізу КДНК бібліотеки ембріонів миші з використанням S6K1 як “байту” ідентифіковано S6K1-звязувальний білок, який згідно біоінформаційного аналізу первинної структури КДНК залучений до біогенезу КОА.
2. Вперше клоновано КДНК КОА-синтази та доведено, що вона є біфункціональним ензимом і каталізує два останні етапи біосинтезу КОА, а саме - утворення ДЕФОСФОКОА та власне утворення КОА.
3. Доведено існування взаємодії S6K1:КОА-синтаза у клітинах ссавців. З використанням делетованих форм S6K1 та КОА-синтази встановлено, що С-кінцеві ділянки цих ензимів залучені до формування білкового комплексу.
4. Методом імунофлуоресцентної мікроскопії вперше встановлено мітохондріальну локалізацію КОА-синтази. З використанням субклітинного фракціонування підтверджено асоціацію КОА-синтази з зовнішньою мембраною мітохондрій.
6. Доведено, що взаємодія між S6K1 та КОА-синтазою не впливає на активність S6K1 та КОА-синтази.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Живолуп О., Немазаний І., Побігайло Н., Панасюк Г., Пальчевський С., Кухаренко О.,. Савінська Л, Овчаренко Г., Вудмаска М., Гут І., Мацука Г., Філоненко В.. Використання дріжджової двогібридної системи для пошуку S6K1 та S6K2 звязувальних партнерів // Біополімери і клітина. - 2002. - Т.18, №2. - С.102-109.
Особистий внесок здобувача - проведено двогібридне скринування КДНК бібліотеки ембріонів миші з використанням S6K1 як “байт”, розроблено методику кількісного виміру росту дріжджових клонів, специфічність отриманих клонів перевірено методом статевого злиття.
2. Zhyvoloup A, Nemazanyy I, Babich A, Panasyuk G, Pobigailo N, Vudmaska M, Naidenov V, Kukharenko O, Palchevskii S, Savinska L, Ovcharenko G, Verdier F, Valovka T, Fenton T, Rebholz H, Wang ML, Shepherd P, Matsuka G, Filonenko V, Gout IT. Molecular cloning of COA Synthase. The missing link in COA biosynthesis // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol.277, №25. - P.22107-10.
Особистий внесок здобувача - автором клоновано КДНК КОА-синтази в бактеріальні та еукаріотичні експресійні вектори, проведено біоінформаційний аналіз первинної структури отриманого клону, проведено Нозерн- та Вестерн-блот аналіз рівня експресії МРНК КОА-синтази в різних тканинах ссавців, виявлено наявність у продукті КДНК двох активностей.
3. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Valovka T., Fenton T., Rebholz H., Wang M. L., Foxon R., Lyzogubov V., Usenko V., Kyyamova R., Gorbenko O., Matsuka G., Filonenko V., Gout I. Subcellular localization and regulation of coenzyme A synthase // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol.278, № 50. - P.50316-21.
Особистий внесок здобувача - отримано рекомбінантні плазміди для вивчення субклітинної локалізації КОА-синтази, проведено імунофлуоресцентний аналіз субклітинної локалізації КОА-синтази, проведено субклітинне фракціонування та аналіз фракцій лізатів клітин.
4. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Pobigailo N., Panasyuk G., Gout I., Filonenko V. The Use of Two-hybrid System for the identification of S6 Kinase Binding Partners // Conference for students, PHD students and young scientists on molecular biology and genetics. -Kyiv (Ukraine), 2001. - P.157.
Особистий внесок здобувача - виконано двогібридне скринування з використанням S6K1 як “байту”.
5. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Filonenko V., Gout I. The identification and functional characterization of novel ribosomal S6 kinase binding partner // Rev. Oncol. - 17th meeting of the Europian Association for Cancer Research. -2002. - Vol.4, Suppl. 1, P.10.
Особистий внесок здобувача - проведено двогібридне скринування з використанням S6K1 як “байту”, виявлено наявність у КДНК ДЕФОСФОКОА-кіназної та фосфопантотенатаденілтрансферазної активностей у отриманого позитивного клону.
6. Filonenko V., Nemazanyy I, Panasyuk G., Zhyvoloup A., Matsuka G., Gout I.T. Identification and characterization of p70S6 kinase binding partners by yeast two hybrid system // 4th PARNAS conference Molecular Mechanisms of Cell Activation, Biological Signals and their target enzymes. - Wroclaw (Poland), 2002. -P.49.
Особистий внесок здобувача - розроблено методику кількісного виміру росту дріжджових клонів на селективних середовищах, специфічність отриманих клонів перевірено методом статевого злиття.
7. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Filonenko V., Matsuka G., Gout I. The use of yeast two-hybrid system for the identification of novel S6 kinase binding partners // The Ukrainian Biochemical Journal. - VIII Ukrainian Biochemical congress, . - 2002. - Vol.74, №4b, Suppl. 2. - P.30.
Особистий внесок здобувача - проведено двогібридне скринування КДНК бібліотеки з використанням S6K1 як “байту”.
8. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Filonenko V., Gout I. COA Synthase: a new binding partner for S6 kinase // FEBS Forum for young scientists - Istanbul (Turkey), 2002. -P.89.
Особистий внесок здобувача -біоінформаційний аналіз первинної структури отриманого клону, Нозерн-блот аналіз експресії МРНК КОА-синтази в різних тканинах ссавців, виявлено наявність у продукті КДНК ДЕФОСФОКОА-кіназної та фосфопантотенат трансферазної активностей.
9. Nemazanyy I., Zhyvoloup A., Panasyuk G., Filonenko V. Subcellular localization and regulation of COA synthase // EJB. - FEBS Special Meeting on Signal Transduction. -2003. - Vol.270, Suppl. 1, P.142.
Особистий внесок здобувача - встановлено мітохондріальну локалізацію КОА-синтази методами конфокальної сканувальної мікроскопії та ультрацентрифугування.
10. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Gout I., Filonenko V. COA synthase binds ribosomal S6 kinase 1 in vivo // Workshop on: The Proteins Controlling Cell Growth And Their Role In Tumour Formation: MTOR, TSC and PTEN.- Madrid(Spain), 2003. -P.57.
Особистий внесок здобувача - з використанням методу імунопреципітації встановлено, що КОА-синтаза специфічно взаємодіє з S6K1 в клітинах ссавців.
11. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Gout I., Filonenko V. COA synthase binds ribosomal S6 kinase 1 in vivo // EJB. - 29th FEBS Meeting. - Warsaw (Poland), 2004. - Vol.271, Suppl. 1, Р.168.
Особистий внесок здобувача - встановлено, що КОА-синтаза специфічно взаємодіє з S6K1 в клітинах ссавців in vivo. Встановлено, що ферменти не впливають на активність одне одного.