Дослідження методики отримання рекомбінантних штамів термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha з підвищеною продукцією формальдегіддегідрогенази та формальдегідредуктази. Аналіз регуляції синтезу цих ферментів у рекомбінантних штамів.
Аннотация к работе
Пошук та генетичне конструювання мікробних продуцентів ферментів, які беруть участь у метаболізмі ФА, можуть мати біоаналітичне значення при розробці нових ензиматичних і біосенсорних систем аналізу ФА. Дисертаційна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу і виконувалась в рамках бюджетних тем: “Створення нових біоаналітичних систем на основі оксидоредуктаз” (№ держреєстрації 0106U002598) та проекту “Розробка і виготовлення експериментальних зразків електрохімічних біосенсорів для аналізу формальдегіду в харчових продуктах, фармацевтичних препаратах та довкіллі” (№ держреєстрації 0107U005246) комплексної науково-технічної програми фундаментальних досліджень НАН України “Сенсорні системи для медико-екологічних та промислово-технологічних потреб”. Робота виконувалась також у рамках міжнародного наукового гранту INTAS OPEN CALL 03-51-6278 “Novel biosensors and analysis kits based on genetically engineered biomolecules for formaldehyde assay”, двох міжнародних індивідуальних проектів: West-Ukrainian BIOMEDICAL Research Center (WUBMRC-2006 та WUBMRC-2007) “New biosensors and analysis kits based on recombinant yeast formaldehyde dehydrogenase for formaldehyde assay”, “Enzyme-and cells-based biosensors for assay of formaldehyde in vaccines, food products and consumer goods” та NATO Linkage Grant LST.NUKR.CLG 980621 “Novel biological and chemical sensors for formaldehyde monitoring in wastewaters, foodstuffs and pharmaceuticals”. Метою роботи було отримати рекомбінантні штами термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha з підвищеною продукцією формальдегіддегідрогенази та формальдегідредуктази, які можуть мати біоаналітичне використання; дослідити особливості регуляції синтезу цих ферментів у рекомбінантних штамів, розробити просту і ефективну схему виділення та очистки формальдегідредуктази із відібраного продуцента та створити нові біосенсорні підходи для визначення формальдегіду на основі рекомбінантних штамів. Предметом дослідження було генно-інженерне конструювання продуцентів формальдегіддегідрогенази та формальдегідредуктази, дослідження регуляції синтезу цих ферментів та створення нових біосенсорних підходів для аналізу вмісту формальдегіду за допомогою рекомбінантних клітин та ферментів.У результаті виконання дисертаційної роботи отримано рекомбінантні штами термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha з підвищеною продукцією формальдегіддегідрогенази і формальдегідредуктази, досліджено особливості регуляції синтезу цих ферментів та створено нові клітинні біосенсори для визначення формальдегіду з використанням сконструйованих рекомбінантних штамів. Основні наукові і практичні результати роботи викладено у наступних висновках: Створено стабільні генно-інженерні надпродуценти дріжджової глутатіон-залежної формальдегіддегідрогенази H. polymorpha шляхом трансформації клітин плазмідами інтегративного типу, що містять одну та дві копії гену FLD1 цього ж організму. Розроблено схему виділення формальдегідредуктази з безклітинних екстрактів рекомбінантного штаму Tf 22-142 шляхом двостадійної іонообмінної хроматографії на аніоніті ДЕАЕ-Toyopearl 650М, що дозволяє отримувати препарат ферменту з питомою активністю понад 10 Од./мг білку. (Здобувач брала участь в опрацюванні робочої схеми експериментальних досліджень, аналізі літературних і експериментальних даних, отримувала рекомбінантні штами та вивчала їх резистентність до формальдегіду). (Здобувач оволоділа методикою біосенсорного аналізу, провела дослідження та статистичну обробку даних, проаналізувала та опрацювала дані літератури, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті).
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Вывод
У результаті виконання дисертаційної роботи отримано рекомбінантні штами термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha з підвищеною продукцією формальдегіддегідрогенази і формальдегідредуктази, досліджено особливості регуляції синтезу цих ферментів та створено нові клітинні біосенсори для визначення формальдегіду з використанням сконструйованих рекомбінантних штамів.
Основні наукові і практичні результати роботи викладено у наступних висновках: Створено стабільні генно-інженерні надпродуценти дріжджової глутатіон-залежної формальдегіддегідрогенази H. polymorpha шляхом трансформації клітин плазмідами інтегративного типу, що містять одну та дві копії гену FLD1 цього ж організму. Встановлено, що рекомбінантні штами містять від 6 до 8 копій цільового гена.
Показано, що одержані трансформанти, резистентні до підвищених концентрацій фомальдегіду - до 20 ММ, за певних умов культивування можуть бути продуцентами не тільки формальдегіддегідрогенази, але і алкогольдегідрогенази, формальдегідредуктази та форміатдегідрогенази. Оптимізовано умови культивування рекомбінантних штамів та досліджено динаміку синтезу цільових ферментів, які беруть участь у метаболізмі формальдегіду.
Розроблено схему виділення формальдегідредуктази з безклітинних екстрактів рекомбінантного штаму Tf 22-142 шляхом двостадійної іонообмінної хроматографії на аніоніті ДЕАЕ-Toyopearl 650М, що дозволяє отримувати препарат ферменту з питомою активністю понад 10 Од./мг білку.
Проведено пошук гомологічних послідовностей гена ADH1 S. cerevisiae в геномі H. polymorpha, знайдено послідовності з 80% гомологією до гену ADH1 S. cerevisiae (Orf 347 та Orf 1014). За допомогою полімеразної ланцюгової реакції ізольовано та ідентифіковано ген ADH1 H. polymorpha, який кодує одну з ізоформ алкогольдегідрогеназ.
Для отримання надпродуцента формальдегідредуктази метилотрофних дріжджів H. polymorpha сконструйовано плазміди експресії р21Sc21 та р21ADH1Hp, що містять гени ADH1 (S. cerevisiae та H. polymorpha, відповідно), під контролем сильного конститутивного промотора гена GAP1 H. polymorpha.
Показано, що дво-кофакторна рекомбінантна формальдегіддегідрогеназа із H. polymorpha може служити стабільним біоселективним елементом для створення імпедансного біосенсора.
Розроблено мікробні амперометричні біосенсори з використанням клітин генно-інженерних надпродуцентів дріжджової глутатіон-залежної формальдегіддегідрогенази Tf 11-6 і Tf 22-126 в ролі біоселективних елементів та апробовано їх при аналізі формальдегіду в реальних зразках формаліну, “Дескотону форте”, “Формідрону” та вакцини проти вірусної геморагічної хвороби кролів.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Конструювання штамів - надпродуцентів формальдегіддегідрогенази метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha / О.М. Демків, С.Я. Парижак, О.С. Красовська, О.В. Стасик, Г.З. Гайда, А.А. Сибірний, М.В. Гончар // Біополімери і клітина. - 2005. - Т. 21, № 6. - С. 525-530. (Здобувач брала участь в опрацюванні робочої схеми експериментальних досліджень, аналізі літературних і експериментальних даних, отримувала рекомбінантні штами та вивчала їх резистентність до формальдегіду).
Дріжджові рекомбінантні штами як продуценти формальдегіддегідрогенази: конструювання, селекція, оптимізація умов культивування / С.Я. Парижак, О.М. Демків, Г.З. Гайда, М.В. Гончар // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. / Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова. - К. Логос, - 2006. - С. 624-627. (Здобувач провела дослідження та статистичну обробку даних, проаналізувала та узагальнила літературні джерела, написала та оформила статтю).
Formaldehyde-sensitive sensor based on recombinant formaldehyde dehydrogenase using capacitance versus voltage measurements / M.B. Ali, M. Gonchar, G. Gayda, S. Paryzhak, M.A. Maaref, N. Jaffrezic-Renault, Y. Korpan // Biosens. Bioelectron. - 2007. - Vol. 22, №12. - Р. 2790-2795. (Здобувач брала участь у препаративному отриманні ферменту, опрацюванні експериментальних даних та написанні статті).
Formaldehyde dehydrogenase from the recombinant yeast Hansenula polymorpha: isolation and bioanalytic application / O. Demkiv, S. Paryzhak, G. Gayda, V.A. Sibirny, М.V. Gonchar // FEMS Yeast Res. - 2007. - Vol. 7, № 7. - P. 1153-1159. (Здобувач провела дослідження, проаналізувала та узагальнила літературні джерела, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та підготовці статті до друку).
Enzyme- and cells-based biosensors for assay of formaldehyde in vaccines / S. Paryzhak, O. Demkiv, G. Gayda, V. Sibirny, W. Schuhmann, М. Gonchar // 2nd Polish-Ukrainian Weigl Conference “Microbiology in the XXI century”, 24-26 September, 2007. - Warszawa, 2007. - P. 170-173. (Здобувач провела апробацію клітинних біосенсорів на реальних зразках вакцин та брала участь у написанні статті).
Reagentless amperometric formaldehydeselective biosensors based on the recombinant yeast formaldehyde dehydrogenase / O. Demkiv, O. Smutok, S. Paryzhak, G. Gayda, Y. Sultanov, D. Guschin, H. Shkil, W. Schuhmann, M. Gonchar // Talanta. - 2008. - Vol. 76. - P. 837-846. (Здобувач оволоділа методикою біосенсорного аналізу, провела дослідження та статистичну обробку даних, проаналізувала та опрацювала дані літератури, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті).
Recombinant formaldehyde dehydrogenase and gene-engineered methylotrophic yeasts as bioanalitycal instruments for assay of toxic formaldehyde / G. Gayda, O. Demkiv, S. Paryzhak, М. Gonchar, W. Schuhmann // Algal Toxins: Nature, Occurrence, Effect and Detection. Series A: Chemistry and Biology. - 2008. - P. 311-333. (Здобувачу належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз власних результатів та написання статті. Дисертант здійснила скринінг низки медіаторів, провела конструювання мікробних біосенсорів та апробувала їх при аналізі формальдегіду в реальних зразках фармацевтичних та дезінфікуючих засобів).
Intact recombinant cells of the yeast Hansenula polymorpha, overproducing formaldehyde dehydrogenase, as the sensitive bioelements for amperometric assay of formaldehyde / S. Paryzhak, O. Demkiv, M. Gonchar, W. Schuhmann // Sensor electronics and microsystem technologies. - 2008. - Vol. 2. - P. 28-38. (Здобувач розробила оптимальну архітектуру клітинного біосенсора із використанням вільнодифундуючого медіатора феназинметосульфату та дослідила основні його характеристики, написала та оформила статтю).
Формальдегідний кондуктометричний біосенсор на основі рекомбінантної формальдегіддегідрогенази дріжджів Hansenula polymorpha / О.Ф. Сосовська, Г.М. Павлішко, С.Я. Парижак, М.В. Гончар, Я.І. Корпан // Біополімери і клітина. - 2008. - Т. 24, № 2. - С. 135-141. (Здобувач отримала препарат рекомбінантної формальдегіддегідрогенази, опрацювала дані літератури та брала участь у написанні статті).
Конструювання штамів-продуцентів формальдегіддегідрогенази для експрес-аналізу вмісту формальдегіду у середовищах довкілля та харчових продуктах: ІІ Всеукраїнська науково-практична конференція [“Біотехнологія. Освіта. Наука”] / О.М. Демків, О.С. Красовська, О.В. Смуток, О.Г. Стасик, С.Я. Парижак, Г.З. Гайда, М.В. Гончар, (Львів, 6 - 8 жовт. 2004 р.). - Львів, 2004. - С. 124.
Парижак С.Я. Конструювання штамів-продуцентів формальдегіддегідрогенази метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha: Перша Міжнародна конференція студентів та аспірантів [“Молодь і поступ біології”] / С.Я. Парижак, О.М. Демків, М.В. Гончар, (11 - 14 квіт. 2005 р.). - Львів, 2005 . - С. 134.
Ефективність різних методів трансформації метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha плазмідами з геном FLD1: ІІ Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів [“Молодь і поступ біології”] / С.Я. Парижак, О.М. Демків, Р.А. Назарук, М.В. Гончар, (21 - 24 берез. 2006 р.). - Львів, 2006. - С. 150.
Development of formaldehyde-sensitive amperometric biosensor based on recombinant formaldehyde dehydrogenase from the gene-engineered yeast Hansenula polymorpha: Abs. of 2d International Conference [“Sensor electronic and Microsystems technologies”] / O. Demkiv, S. Paryzhak, O. Smutok, G. Gayda, M. Gonchar, W. Schuhmann, (26 - 30 June 2006.). - Odessa, 2006 . - P. 171.
Дріжджова формальдегіддегідрогеназа як аналітичний інструмент при визначенні вмісту формальдегіду ензиматичним та біосенсорними методами: Міжнародна наукова конференція [“Мікробні біотехнології”] / О.М. Демків, С.Я. Парижак, О.В. Смуток, Г.М. Павлішко, Г.З. Гайда, М.В. Гончар, (11-15 вересня 2006 р.). - Одеса, 2006 . - С. 119.
Formaldehyde dehydrogenase from recombinant Hansenula polymorpha strain and its bioanalytical application: 4th Hansenula Polymorpha Worldwide Network Conference / M. Gonchar, O. Demkiv, S. Paryzhak, O. Smutok, G. Gayda, W. Schuhmann, (3-5 September 2006). - Haren (Netherlands), 2006. - P. 22.
Детоксикація формальдегіду клітинами рекомбінантних штамів метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha: 2-ий Зїзд Українського товариства клітинної біології / С.Я. Парижак, О.М. Демків, Г.З. Гайда, М.В. Гончар, (Київ, 23-26 жовт. 2007 р.). - Київ. 2007. - С. 79.
Paryzhak S. Bioanalytical application of formaldehyde dehydrogenase from the recombinant yeast Hansenula polymorpha: 3d International Conference for Students and Post-graduates [“Youth and Progress in Biology”] / S. Paryzhak, O. Demkiv, O. Ishchuk, (April 23-27 2007). - Lviv, 2007. - P. 179.
Enzyme- and cells-based bioanalytic approaches for assay of formaldehyde in consumer goods, environment and biological samples: RECOOP HST Cons. [“Bridges in Life Sciences”] / S. Paryzhak, O. Demkiv, G. Gayda, W. Schuhmann, M. Gonchar, (5 October 2007). - Pecs, (Hungary), 2007. Vol. 1, N 1. - P. 78.
Formaldehyde dehydrogenase from genetically modified methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: isolation and characterization: Intern. conf. [“Biocatalysis - 2007: Fundamentals and Applications”] / G. Gayda, O. Demkiv, S. Paryzhak, M. Gonchar, (17-22 June, 2007). - Moscow-St. Petersburg, 2007. - P. 94.
Парижак С.Я. Генно-інженерне конструювання штамів-продуцентів формальдегідредуктази термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha: Міжнародна конференція студентів та аспірантів [“Молодь і поступ біології”] / С.Я. Парижак, М.С. Щоголєва, (7 - 10 квітня. 2008 р.). - Львів, 2008. - С. 143 - 144.
Construction of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha strains overproducing formaldehyde reductase: 12th International Congress on Yeasts / S. Paryzhak, M. Shchoholeva, Y. Rebets, M. Gonchar, (11-15 August, 2008). - Kyiv, 2008. - P. 269.
Formaldehyde reductase from formaldehyde-resistant gene-engineered methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: isolation and characterization: 12th International Congress on Yeasts / G. Gayda, S. Paryzhak, O. Demkiv, H. Ksheminska, M. Gonchar, (11-15 August, 2008). - Kyiv, 2008. - P. 304.
Recombinant cells of the yeast Hansenula polymorpha overproducing enzymes of analytical importance as the biorecognition elements: 12th International Congress on Yeasts / M. Gonchar, O. Smutok, O. Demkiv, S. Paryzhak, O. Zakalska, K. Dmytruk, A. Sibirny, (11-15 August, 2008). - Kyiv, 2008. - P. 312.
Формальдегідний кондуктометричний біосенсор на основі рекомбінантної формальдегіддегідрогенази дріжджів Hansenula polymorpha: 3-я Міжнародна науково-технічна конференція [“Сенсорна електроніка та мікросистемні технології”] (СЕМСТ - 3) / О.Ф. Сосовська, Г.М. Павлішко, С.Я. Парижак, М.В. Гончар, Я.І. Корпан, (2-6 черв. 2008 р.). - Одеса, 2008 . - С. 94.
Cells-based amperometric biosensors for formaldehyde monitoring in biological samples: RECOOP HST Cons. [“Bridges in Life Sciences”] / S. Paryzhak, O. Demkiv, W. Schuhmann, M. Gonchar, (4 October, 2008). - Zagreb, (Croatia), 2008. Vol. 2, N 1. - P. 48.
Оксидоредуктази та рекомбінантні клітини дріжджів як аналітичні інструменти: М.В. Гончар, Г.З. Гайда, О.В. Смуток, Г.М. Павлішко, О.М. Демків, С.Я. Парижак // VIII Українська конференція з аналітичної хімії (8-12 вересня 2008 року, м. Одеса). - Одеса: Атлант, 2008. - С. 40.