Клинико-диагностическое значение определения антител к глутатионредуктазе и супероксиддисмутазе у больных системной склеродермией с использованием иммобилизированных форм ферментов - Автореферат
Активность супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы, содержание антител к этим ферментам у больных системной склеродермией и здоровых лиц. Оценка клинической эффективности лечения системной склеродермии с помощью иммобилизированных форм данных ферментов.
Аннотация к работе
Системная склеродермия (прогрессирующий системный склероз) - прогрессирующее полисиндромное заболевание с характерными изменениями кожи, опорно-двигательного аппарата, внутренних органов (легких, сердца, пищеварительного тракта, почек) и распространенными вазоспастическими нарушениями по типу синдрома Рейно, в основе которых лежат поражение соединительной ткани с преобладанием фиброза и сосудистая патология по типу облитерирующего эндартериолита. Преимущественное поражение лиц трудоспособного возраста при данном заболевании, высокий процент инвалидизации порождают большие экономические потери, включающие высокую стоимость диагностики и лечения, исключение больных из сферы производства, затраты на социальное обеспечение работающих пациентов и инвалидов (Фоломеева О.М. и соавт., 2004, Jonson S.R. et al., 2006). В настоящее время исследованы патогенетические механизмы системной склеродермии (ССД), детально изучены клиника и эволюция заболевания, разработаны основы диагностики и классификация, создана программа патогенетической терапии с дифференцированным использованием антифиброзных, иммуномодулирующих и сосудистых средств (Гусева Н.Г., 2007). Как показали новейшие разработки в иммунодиагностике ревматических заболеваний, иммуноферментные методы анализа (ИФА) с использованием магнитоуправляемых сорбентов на основе антигенов нуклеиновой, липидной и белковой природы значительно облегчают задачи ревматолога. Иммобилизированные магнитосорбенты на основе КАТ, ГП и ЦП уже были использованы для усовершенствования иммунодиагностики ССД, что позволяет решать вопросы ранней диагностики заболевания благодаря высокой чувствительности и специфичности данного метода ИФА (Петрова Н.В., 2001, Москвитина О.В., 2009).
Список литературы
Основные положения диссертации изложены в 18 печатных работах, из которых 11 - в центральной, 1 - в международной и 6 - в местной печати, в том числе 9 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на ежегодной научной конференции студентов и молодых ученых ВОЛГМУ (2009 - 2011 г.г.); III Национальном конгрессе терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации», Москва 5-7 ноября 2008 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», Чита, 2008 г.; IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении», 21-22 апреля 2009 г.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I - обзора литературы, в которой изложены современные аспекты иммунопатогенеза системной склеродермии, участии в ее развитии активных форм кислорода и антиоксидантной системы; части II - собственных исследований, состоящей из 6 глав, содержащих клиническую характеристику больных, методики исследования, полученные результаты, их обсуждение, выводы, практические рекомендации и приложения. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 5 рисунками, приведено 2 выписки из историй болезни. Указатель литературы содержит 244 источника, в том числе 97 - отечественных и 147 - зарубежных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Клиническая характеристика больных
Под наблюдением находилось 40 больных системной склеродермией, соответствовавших критериям включения в обследование: 38 женщин (95,0%) и 2 мужчин (5,0 %) в возрасте от 18 до 65 лет.
Диагноз ставился по критериям Американской ревматологической ассоциации (1980 г.) в соответствии с рабочей классификацией Н.Г.Гусевой (1975 г.).
Из общего числа обследованных - 30 человек (75%) относились к социально активному населению. Средний возраст пациентов - 38±3,3 лет - приближен к опубликованным статистическим данным о возрастной группе при ССД, что дает возможность экстраполировать свойства выборочной совокупности на генеральную (рис.1).
Средняя продолжительность болезни в исследуемой группе составила 7,7±4,16 лет. Стаж заболевания до 5 лет отмечался у 17 пациентов (42,5%), 6-10 лет - у 10 (20,0%), 11-15 лет - у 9 (22,5%), свыше 15 лет - у 4 (10,0%). Среди наблюдаемых нами больных инвалидность по данному заболеванию имели 23 человека (57,5%), из них 18 человек - трудоспособного возраста.
По степени активности патологического процесса больные распределились следующим образом: I степень была диагностирована у 16 человек (40,0%), II степень - у 23 человек (57,5%), III степень - у 1 (2,5%) пациента.
У 16 больных (40,0%) течение заболевания расценено как хроническое (медленно прогрессирующее), у 23 (57,5%) - как подострое (умеренно прогрессирующее), у 1 (2,5%) - как острое (быстро прогрессирующее). Ввиду малого количества больных с острым течением и максимальной активностью, пациенты с острым и подострым течением, II и III степенями активности в дальнейшем будут рассматриваться в одной группе.
Рисунок 1. Распределение больных в зависимости от возраста начала болезни.
При хроническом течении ССД у подавляющего большинства больных (87,5%) наблюдалась низкая активность заболевания. Подострое течение в 78,3% случаев сопровождалось умеренной активностью заболевания. Максимальная степень активности патологического процесса имела место у пациентки с острым течением (рис.2).
Рисунок 2. Зависимость характера течения от активности ССД.
I (начальная) стадия заболевания диагностирована у 10 (25,0%) больных, II (генерализованная) - у 26 (65,0%), III (терминальная) - у 4 (10,0%) пациентов.
Среди пациентов с продолжительностью заболевания менее 5 лет стадия начальных проявлений была диагностирована в 64,7% случаев (11 пациентов), II стадия - у 35,3% больных. У лиц со стажем болезни 6-10 лет это соотношение составило 50,0% (I стадия) против 50,0% (II стадия). При продолжительности заболевания 11 - 15 лет в 88,9% случаев (8 больных) наблюдалась стадия выраженных изменений (II), у одного пациента- III стадия. В группе больных с более чем 15-летним стажем болезни в 75,0% случаев была диагностирована II стадия (3 больных), а в 25,0% - III (терминальная) стадия заболевания. Приведенные данные демонстрируют сравнительно быструю генерализацию процесса при ССД с развитием необратимых изменений у некоторых больных уже в первые 5 лет болезни (рис. 3).
Рисунок 3. Зависимость стадии ССД от длительности заболевания.
Клиническая картина ССД в опытной группе отличалась полиморфностью и полисиндромностью, отражая системный характер заболевания. Однако изменения кожи, являющиеся одним из ведущих диагностических признаков заболевания, определялись у всех обследованных больных. Наиболее частыми проявлениями были маскообразность лица, склеродактилия, гиперпигментация и выпадение волос.
В зависимости от степени распространенности изменений кожи у 27 (67,5%) больных была диагностирована лимитированная форма ССД, у 13 (32,5%) - диффузная. Последняя, как правило, ассоциировалась с подострым и острым течением заболевания.
Суставной синдром был диагностирован у всех пациентов (100,0%), мышечный - у 2 больных (5,0%), создавая наряду с кожными проявлениями и синдромом Рейно картину характерного для ССД периферического симптомокомплекса. Поражение опорно-двигательного аппарата включало полиартриты - 19 пациентов (47,5%), полиартралгии - 10 (25,0%), миозиты и миалгии - 16 (40,0%), остеолиз - 3 (7,5%), кальциноз мягких тканей - 3 (7,5%).
Вторым по распространенности проявлений ССД в исследуемой группе был синдром Рейно. Он встречался у 32 пациентов (80,0%), при этом наблюдалась как типичная локализация вазоспастических проявлений (кисти, стопы), так и редкая - губы, кончик языка. Дигитальные ишемические нарушения имели место у 5 больных (12,5%).
Из висцеральной патологии наиболее часто (в 80,0% случаев) наблюдалось поражение ЖКТ в виде эзофагита, гастродуоденита, колита, гипотонии пищевода и кишечника, грыжи пищеводного отверстия диафрагмы. Диагноз во всех случаях был подтвержден данными рентгенологического и/или эндоскопического исследования.
Особое внимание уделялось исследованию сердечно-сосудистой системы, поскольку ее поражение является, по мнению ряда авторов, основной причиной внезапной смерти больных ССД. Кардиальная патология выявлялась у 20 пациентов (50,0%) и была представлена в основном ишемической болезнью сердца (стенокардия напряжения и покоя, острый инфаркт миокарда в анамнезе) - 13 человек. Диагноз стенокардии выставлялся клинически при наличии типических ангинозных приступов, а у ряда пациентов верифицирован пробой с физической нагрузкой (ВЭП, тредмил-тест). В 10,0% случаев при ЭХОКГ-исследовании выявлялось нарушение сократительной способности миокарда (снижение ФВ менее 55% по Тейкхольцу), обусловленное некоронарогенным кардиосклерозом. У 4 человек (20,0%) обнаруживались явления перикардита в виде утолщения оболочки и наличия небольшого количества жидкости, у 3 человек - пролапс митрального клапана (15,0%).
Легочные проявления (базальный пневмофиброз, адгезивный плеврит, легочная гипертензия) встречались в 90,0% случаев (36 пациентов). У 10 человек (25,0%) поражение легких было бессимптомным и выявлялось при рентгенологическом обследовании, иногда предшествуя кожным проявлениям и синдрому Рейно. У остальных пациентов отмечалась скудность симптоматики на начальной стадии заболевания и манифестирование легочного синдрома в стадии генерализации процесса, а в ряде случаев - в терминальной стадии.
Поражение нервной системы отмечалось у 12 пациентов (30,0%) и включало явления церебрального васкулита - у 8 больных (66,7%) и сенсорной невропатии (чаще в рамках полиневритического синдрома) - у 4 больных (33,3%). Церебральные проявления были документированы неврологом при осмотре и/или специальном обследовании (РЭГ). Имевшиеся в анамнезе ОНМК или ТИА, связанные по времени с обострением основного заболевания, были расценены нами как проявления васкулита данной локализации.
Таблица 1
Параметры основных лабораторных показателей у больных ССД
Показатель значения Количество больных %
Количество эритроцитов <3,5•1012 /л 5 12,5
Гемоглобин <155 г/л 5 12,5
СОЭ >20 мм/ч 14 35,0
АНФ 28 70,0
Серомукоиды >0,28г/л 3 7,5
ЦИК >4 усл.ед. 23 57,5
АТ к Scl -70 16 40,0
Общий белок сыворотки <62г/л 12 30,0 g-глобулины >19,0% 8 20,0
Нормальные показатели даны согласно практическим рекомендациям, приведенным в соответствующих руководствах.
Из общих проявлений наиболее часто наблюдалась потеря массы тела. В период генерализации процесса данный симптом встречался у 24 больных.
Базисную терапию D-пеницилламином в дозах 125 - 750 мг/сут. получали 21 человек (52,5%). Глюкокортикостероиды системного действия в дозах 2,5 - 40 мг/сут. принимали 27 (67,5%) больных, в основном со II и III степенями активности заболевания. Во всех случаях учитывались рекомендации EULAR по применению системной глюкокортикоидной терапии при ревматических заболеваниях.
Из нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), назначенных 36 больным (90,0%), предпочтение отдавалось селективным ингибиторам ЦОГ-2 (нимесулид, мелоксикам), несколько реже назначались кетопрофен и диклофенак.
В качестве патогенетических средств, влияющих на систему микроциркуляции, использовали блокаторы кальциевых каналов (нифедипин, амлодипин) и ингибиторы АПФ (каптоприл, эналаприл, периндоприл, лизиноприл), обладающие к тому же нефропротективным действием. Дозы препаратов подбирались индивидуально в зависимости от уровня АД и переносимости.
В систему комплексного лечения больных ССД включали также ЛФК, массаж и локальную терапию (аппликации с 50-70% раствором диметисульфоксида, ультразвук, лазер). Все больные проходили курс лечения в отделении гипербарической оксигенации МУЗ ГКБ № 25. Использовался бароаппарат «ОКА-МТ», РД (рабочее давление) = 1,3 атмосфер в 1 минуту, продолжительность процедуры 50 минут, количество сеансов 10.
В исследуемой группе ФТЛ получали 23 больных (57,5%).
Плазмаферез назначался 15 пациентам (37,5%). Средняя продолжительность госпитализации составила 21,9±5,9 дней (диапазон от 14 до 40 дней).
Эффект от проводимой терапии оценивался по динамике кожного синдрома (уменьшение индурации); сутавно-мышечного (увеличение объема движений); сосудистого (уменьшение синдрома Рейно, улучшение трофики); регрессии висцеральных проявлений.
В качестве антигена при определении АТ к СОД использовали коммерческий препарат СОД из эритроцитов человека производства НПО «Биопрепарат» с активностью 30 Ед/мг, при определении АТ к ГР - препарат производства НПК «Спутник» с активностью 340 Ед/мг. Активность СОД определяли по методу С. Чевари и соавт. (1993), активность ГР - по методу Hosoda и Nakamura, описанному М.А. Шифриным (1977).
АТ к СОД и ГР определялись твердофазным иммуноферментным методом с использованием ИГАП. Иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля (Гонтарь И.П. с соавт., 2002 г.). Результаты учитывали на многоканальном спектрофотометре АС-8К (Белоруссия) при длине волны 492 нм. Полученные значения выражали в единицах оптической плотности (е.о.п.). Наличие антител считалось положительным при превышении величин экстинции на 2 стандартных отклонения от средних значений контрольной группы.
Обработка полученных результатов проводилась с использованием программных пакетов «STATGRAPHICS 3,0», «Excel 5,0», «STATISTICA 6,0», а также по оригинальным программам с использованием формул, приведенных в соответствующих руководствах (Зайцев В.М. и др., 2003 г.).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Активность ГР и СОД и уровень антител к ним у здоровых лиц
Уровень АТ к ГР и СОД в сыворотке крови исследовали методом ИФА с использованием ИГАП (Гонтарь И.П. и соавт., 2002 г.) у 30 практически здоровых людей - доноров отделения переливания крови городской клинической больницы скорой медицинской помощи №25 (ГКБСМП), г. Волгограда. Уровень нормальных показателей антител, определяемый как сумма среднего и двух среднеквадратических отклонения (М ± 2d), составил по данным ИФА: к СОД - 0,076±0,004 е.о.п.; к ГР - 0,080±0,004 е.о. п.
Показатели, превышающие эти значения на величину 2 стандартных отклонений, были приняты за верхнюю границу нормы: для АТ к СОД - 0,114 е.о.п., для АТ к ГР - 0,124 е.о.п.
Общая активность СОД в группе здоровых составила 38,2 ± 1,2 МЕ, амплитуда колебаний величины активности - 25,1-51,3 МЕ, общая активность ГР - 114,3 ± 3,7 МЕ, а амплитуда - 73,6-155,0 МЕ.
Активность ГР и СОД и уровень антител к ним у больных ССД
У 40 больных ССД, обследованных нами, выявлена средняя активность СОД 22,7±2,6, активность ГР 76,3±3,3, а также достоверное повышение количества антител к ферментам у больных ССД по сравнению со здоровыми (АТ к СОД 0,130 ± 0,007, p < 0,001; АТ к ГР 0,144 ± 0,01, p < 0,001). Между антителами к СОД и ГР отмечена прямая корреляционная зависимость (p=0,040).
Процент повышенных значений АТ к СОД в группе обследованных больных ССД составил 87,5% (35 человек), АТ к ГР 80% (32 больных), при этом достоверного различия активности ферментов и концентраций антител к ним в зависимости от возраста и пола выявлено не было. Недостаточная ферментативная активность ГР и СОД при ССД может быть обусловлена следующими причинами: снижением количества их плазменной и эритроцитарной формы и/или ингибицией фермента под влиянием экзогенных и эндогенных факторов. Известно, что самым мощным эндогенным фактором, приводящим к угнетению ферментной активности, является образование специфических аутоантител. Их подавляющее действие осуществляется путем изменения конформации молекулы ГР и СОД и непосредственной блокады их активных центров, участвующих в реакциях взаимодействия со свободными радикалами. Очевидно, что в условиях аутоагрессии, имеющей место при аутоиммунных заболеваниях, даже повышение синтеза ферментов не может компенсировать их функциональной недостаточности.
Таблица 2
Активность СОД и ГР и содержание АТ к ним в сыворотке крови здоровых и больных ССД в зависимости от активности процесса
Группа n Активность СОД, Ед/мл (М±m) АТ к СОД, е.о.п. (М±m) Активность ГР, Ед/мл (М±m) АТ к ГР, е.о.п. (М±m)
Больные ССД, I степень активности 16 25,1±3,2 0,150±0,003 88,2±3,9 0,130±0,004
II-III степень активности 24 20,2±2,7 0,210±0,003 64,3±3,2 0,180±0,003
В литературе отсутствует описание механизмов приобретения ферментами свойств аутоантигенов, однако предполагается, что конформационное изменение молекулы фермента может происходить в результате взаимодействия с АФК и вторичными продуктами свободнорадикальных процессов. Это приводит к экспрессии скрытых антигенных эпитопов ГР и СОД, вследствие чего они и получают свойства аутоантигенов.
Был проведен анализ показателей активности ГР и СОД и содержания антител к ним у больных ССД с различной степенью активности патологического процесса. Как видно из таблицы 2, в группе больных ССД отмечалось уменьшение активности СОД и ГР в крови по сравнению со здоровыми лицами.
У больных с низкой активностью ССД снижение данных показателей было незначительным (р=0,068 и р=0,072 соответственно), в то время как при умеренной и высокой активности заболевания различия между опытной и контрольной группами были статистически достоверными (р=0,013 и р=0,024 соответственно).
Концентрация антител к ГР и СОД у больных с различной степенью активности ССД была достоверно выше уровня аналогичного показателя у доноров (р=0,043 и р=0,037 соответственно). Имела место отчетливая тенденция к росту содержания аутоантител и снижению количества ферментов в крови больных с повышением активности патологического процесса (рис 4), что обусловило статистически достоверную разницу между подгруппами больных с минимальной и умеренно-максимальной степенью активности заболевания (р=0,039 и р=0,044).
Уровень АТ к ГР и СОД у больных с умеренной активностью патологического процесса был достоверно выше, чем у доноров (р=0,016 и р=0,008 соответственно) и у больных с минимальной степенью активности болезни (р=0,035 и р=0,026 соответственно). Достаточно убедительным являлось снижение концентрации сывороточных АТ к ГР и СОД на фоне лечения (р=0,041 и р=0,047 соответственно), что, вероятно, обусловлено более частым назначением глюкокортикостероидов и плазмафереза больным со II степенью активности заболевания.
Рисунок 4. Активность ГР и СОД и антител к ним у больных ССД с различной степенью активности заболевания.
Измерение активности ГР и СОД у больных ССД перед выпиской из стационара показало на фоне общего клинико-лабораторного улучшения положительную динамику в виде повышения активности исследуемых ферментов. Очевидно, это связано с наблюдаемым у большинства больных снижением активности патологического процесса в ответ на проводимую иммуносупрессивную терапию, при этом отмечалось статистически значимое уменьшение концентрации специфических аутоантител.
Таблица 3
Активность ГР в плазме крови и содержание антител к ней у больных с различным характером течения ССД
Течение n Время обследования Активность ГР, Ед/мг (M±m) АТ к ГР, е.о.п. (M±m)
Хроническое 16 До лечения 110,5±3,7 0,130*±0,011
После лечения 113,8±2,9 0,095±0,060
Подострое и острое 24 До лечения 71,2*±2,8 0,174*#±0,118
После лечения 94,1±1,8 0,118±0,009
Примечание: * - достоверные различия с группой доноров;
# - достоверные различия между клиническими группами;
Анализ активности ГР и СОД в крови и содержания антител к ним у больных с различным характером течения ССД представлен в таблицах 3 и 4.
Как видно из таблиц, при поступлении в стационар у всех больных ССД, независимо от характера течения заболевания, отмечалось уменьшение активности ГР и СОД в крови (р=0,024 и р=0,030 соответственно). Повышение сывороточных АТ к ферментам также наблюдалось во всех группах (р=0,042 и р=0,037 соответственно), но было более выражено при подостром и остром течении заболевания, однако достоверных различий в показателях между рассматриваемыми категориями пациентов найдено не было.
Как было показано ранее, наличие АТ к ГР и СОД ассоциировалось с более выраженным снижением активности фермента (р=0,023 и р=0,035 соответственно).
По окончании курса лечения наблюдалось некоторое повышение активности ГР и СОД в крови и снижение содержания аутоантител. В группе больных с хроническим течением заболевания концентрация исследуемых антител перед выпиской достигла нормальных значений, а при остром и подостром течении сохранялась достоверная разница с группой доноров, что обусловлено преобладанием среди них пациентов с умеренной и максимальной активностью заболевания.
Таблица 4
Активность СОД в плазме крови и содержание антител к ней у больных с различным характером течения ССД
Течение n Время обследования Активность СОД, Ед/мг (M±m) АТ к СОД, е.о.п. (M±m)
Хроническое 16 До лечения 32,4±1,2 0,160±0,006
После лечения 36,1±1,7 0,082±0,050
Подострое и острое 24 До лечения 22,7*±2,7 0,179*±0,180
После лечения 28,4±2,2 0,110±0,070
Примечание: * - достоверные различия с группой доноров
Нами было проанализировано возможное влияние стадии заболевания на активность ГР и СОД и содержание антител к ним у больных ССД. Различия исходных значений АТ к СОД и АТ к ГР в зависимости от стадии ССД приведены в таблице 5. После проведенного лечения у больных ССД отмечалось снижение концентрации сывороточных АТ к ГР и АТ к СОД (р=0,012 и р=0,034 соответственно).
Таблица 5
Содержание антител к ГР и СОД у больных ССД в зависимости от стадии заболевания
Показатель I стадия II стадия III стадия
Количество больных 10 26 4
АТ к ГР, е.о.п. (M±m) 0,125±0,022* 0,160±0,017† 0,320±0,026†*
АТ к СОД, е.о.п. (M±m) 0,111±0,013# 0,129±0,008‡ 0,206±0,013‡#
Отдельно был проведен анализ содержания исследуемых АТ у пациентов, имевших продолжительность заболевания менее 1 года. АТ к ГР и СОД в сыворотке крови были обнаружены нами у обоих пациентов этой группы. Данный факт свидетельствует о том, что АТ к изучаемым показателям появляются на начальных стадиях болезни и могут, таким образом, служить в качестве раннего диагностического признака.
Достоверных изменений активности ГР и СОД на различных стадиях ССД выявлено не было.
Изучение активности ГР и СОД в крови больных ССД с различными клиническими проявлениями выявило достоверное снижение данного показателя во всех рассматриваемых группах (табл.6). Минимальные значения активности как ГР, так и СОД выявлялись у больных с поражением сердца и легких, обуславливая достоверные различия между представленными клиническими группами (р=0,029 и р=0,36 соответственно). Значимое повышение их активности в процессе лечения наблюдалось у больных с кардиальной патологией (р=0,041, р=0,034 соответственно).
Таблица 6
Содержание антител к СОД и ГР у больных ССД в зависимости от клинических проявлений заболевания
Группы n До лечения После лечения
АТ к СОД, е.о.п. M (m) АТ к ГР, е.о.п. M (m) АТ к СОД, е.о.п. M (m) АТ к ГР, е.о.п. M (m)
Поражение нервной системы 12 0,104* (0,028) 0,09* (0,006) 0,085 (0,09) 0,069 (0,004)
Примечание: * - достоверные различия с группой доноров;
# - достоверные различия между клиническими группами;
^ - достоверные различия между показателями до и после лечения.
Анализ содержания АТ к ГР и СОД у больных ССД с поражением различных органов и систем показал, что достоверное повышение их концентрации наблюдается во всех клинических группах (р=0,032 и р=0,025 соответственно). Наиболее высокий уровень исследуемых антител отмечался у пациентов с поражением сердца и легких, при этом он статистически достоверно превосходил аналогичные показатели больных с другими висцеральными проявлениями (р<0,001). Действительно, кардиальная патология по типу ИБС или некоронарогенного кардиосклероза выявлялась у 17 положительных по АТ к ГР и у 15 - положительных по АТ к СОД больных, поражение легких - у 16 пациентов, позитивных по АТ к ГР и у 20 пациентов; позитивных по АТ к СОД.
Динамическое наблюдение за уровнем антител показало, что значимое снижение исследуемых показателей происходило в половине рассматриваемых групп: у больных с поражением костно-мышечной системы, легких и сердца (р=0,048), в ряде случаев достигая нормальных значений.
Известно, что снижение активности ГР и СОД сопряжено с повышенным риском возникновения сердечно-сосудистых заболеваний (именно с этим связывают рост ИБС в селендефицитных зонах). Обнаруженные нами закономерности позволяют предположить, что АТ к ГР и СОД, подавляя их антиоксидантную активность, являются еще одним фактором в цепи развития атеросклеротического процесса.
Есть данные, что ГР и СОД регулируют синтез эйкозаноидов: под их влиянием повышается продукция простациклинов, и, напротив, при дефиците ферментов происходит сдвиг в сторону тромбоксанов. Учитывая выявленные закономерности антителообразования к ГР и СОД у этих больных, можно сделать вывод, что среди известных сегодня механизмов участия ГР и СОД в патогенезе ишемии не последнюю роль играют иммунные.
Повышение уровня АТ к ГР и СОД, сопровождающееся снижением их ферментативной активности, выявленное в группе пациентов с поражением легких, позволило предположить о возможном их участии в развитии указанной патологии. Как известно, патогенез фиброзирующего альвеолита и интерстициального фиброза - основных составляющих легочной патологии при ССД - связан с иммунными нарушениями, усилением свободнорадикальных реакций и процессов фиброгенеза. Использование определения АТ к ГР и СОД в качестве предиктора развития угрожающих жизни осложнений со стороны легких при ССД позволяет обоснованно и дифференцированно подходить к назначению дорогостоящих методов диагностики (компьютерная томография, МРТ) и своевременно производить коррекцию начинающихся нарушений, используя тактику "агрессивной" терапии. Другая немаловажная проблема, которая была включена нами в задачи исследования - объективизация оценки эффективности проводимой терапии. Сегодня контроль лечения включает в себя стандартный набор клинико-лабораторных тестов, характеризующих, в основном активность патологического процесса (показатели острой фазы) и мониторинг уровня отдельных классов антител (анти-ДНК, антифосфолипидные антитела (АФЛ), антинуклеарный фактор (АНФ). В этом свете особый интерес представляет оценка влияния проводимой терапии на динамику АТ к ГР и СОД и их активность. Для повышения достоверности полученных результатов нами были отобраны больные с подострым течением и умеренной активностью заболевания, имевшие сходные клинико-лабораторные показатели.
Таблица 7
Активность ГР и СОД и АТ к ним у больных ССД в зависимости от вида проводимой терапии
Терапевтические группы n Время обследования Активность ГР, ЕД/мл (M±m) Активность СОД, ЕД/мл (M±m) АТ к ГР, е.о.п (M±m) АТ к СОД, е.о.п. (M±m)
I 10 До лечения 64,2±1,18* 20,2±1,2* 0,175± 0,008 0,185±0,007
После лечения 84,1±0,69 25,4±0,9 0,105±0,010 0,10±0,004
II 6 До лечения 63,8±1,8 19,8±1,1 0,188±0,010 0,215±0,010*
После лечения 79,7±0,33 22,5±0,9 0,081±0,007 0,10±0,010
III 4 До лечения 61,1±0,43 16,8±2,0 0,189±0,008* 0,224±0,018
После лечения 71,9±0,38 20,7±0,5 0,095±0,005 0,096±0,008
Примечание: * - достоверные различия с группой доноров;
Эта достаточно однородная выборка была разделена на три группы в зависимости от вида проводимой терапии. В I группе (10 человек) - получали антифиброзную терапию (D-пеницилламин) в комбинации с сосудистыми препаратами; во II группе (6 человек) помимо основной терапии пациенты получали ГКС per os; в III группе (4 человека) основное лечение дополнялось методами экстракорпоральной терапии (плазмаферез). Результаты изучения активности ГР и СОД и содержания аутоантител к ним в зависимости от вида проводимой терапии представлены в таблице 7.
Во всех группах произошло уменьшение количества АТ к ГР и СОД к моменту выписки из стационара, но достоверное снижение наблюдалось у больных, получавших ГКС системного действия (р=0,042 и р=0,038 соответственно), и особенно у принимавших процедуры плазмафереза (р=0,083 и р=0,074 соответственно). Процент повышенных значений антител к СОД, ГР до лечения составлял 75% и 70% соответственно, а при выписке - 38,0 %, 36,7 %. Уровень антител при выписке остается выше, чем у здоровых лиц (p=0,041 и р=0,039 соответственно).
Полученные результаты свидетельствуют о преимуществах включения в комплексное лечение больных ССД глюкокортикостероидных препаратов и экстракорпоральных методов, приводящих к быстрому значимому снижению интенсивности антителогенеза и уменьшению активности патологического процесса.
При этом необходимо оценивать риск развития осложнений, достигающий, по данным ряда авторов, 10-20%. Наиболее частыми из них являются тромбозы, кровотечения, гемолиз, цитратная гипокальциемия, иммунодефицитные состояния. Так, отмечена более высокая частота бактериальных и вирусных инфекций при сочетании плазмафереза и пульс-терапии ГКС и/или цитостатиками по сравнению с монотерапией указанными препаратами. Кроме того, эффект от плазмафереза наступает быстро, но часто носит кратковременный характер, в то время как прием иммуносупрессивных препаратов приводит к более стойкому подавлению поликлональной В-клеточной активации и гиперпродукции аутоантител. Базисная терапия способствует замедлению прогрессирования заболевания и препятствует фиброзообразованию, существенно не изменяя интенсивность иммунного ответа. Таким образом, экстракорпоральные методы являются элементом комплексного лечения ССД и не могут служить альтернативой противовоспалительной и базисной терапии, но должны применяться в случае необходимости быстрого подавления аутоиммунной активности.
Поскольку выявленные нами АТ к СОД и ГР у лиц с ССД отсутствовали у доноров, нами проведены количественные оценки эффективности использования антител в качестве критерия диагностической ценности.
Диагностическую ценность изучаемых лабораторных тестов при ССД оценивали методом ROC-анализа, используя в качестве контроля группу больных первичным синдромом Рейно. При выборе оптимальной точки разделения для каждого из тестов руководствовались оптимальными значениями отношений правдоподобия.
Рисунок 5. Характеристические кривые определения уровня антител к СОД и ГР в диагностике ССД.
Поиск точек разделения между исследуемыми группами производили, руководствуясь максимальной суммой значений чувствительности и специфичности. Точкой разделения, удовлетворяющей этому требованию, для анти-ГР являлось значение 0,507 е.о.п. (при этом чувствительность составила 37,50%, специфичность - 100,00%), а для анти-СОД - 0,695 е.о.п., (чувствительность - 40,00 %, специфичность - 95,00%).
В связи с тем, что иммунные механизмы играют ведущую роль в развитии системных заболеваний соединительной ткани, именно иммунологическим методам придается большое значение в диагностике ССД. Используемые для объективизации диагноза, они позволяют верифицировать заболевание, определить его активность, представить ориентировочный прогноз по течению и выбрать оптимальную терапевтическую тактику. Повышение чувствительности и специфичности иммунологических методов, а также совершенствование технических аспектов постановки реакций является важным методическим направлением современной ревматологии.
Для выявления специфических антител в сыворотках крови больных ССД нами был выбран иммуноферментный метод с использованием иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами. ИФА, будучи высокоспецифичным и чувствительным, является наиболее информативным методом в диагностике ревматических заболеваний (РЗ), а применение иммобилизированных биополимеров дает ему целый ряд неоспоримых преимуществ. Сорбенты обладают механической прочностью, устойчивы к экзогенным физико-химическим и биологическим воздействиям, а возможность проведения регенерации позволяет добиться неоднократного их применения, что ведет к значительному экономическому эффекту.
Для совершенствования иммунологической диагностики ССД нами были разработаны и целенаправленно апробированы при выявлении специфических антител у 40 больных ССД и у 30 здоровых лиц иммобилизированные гранулированные антигенные препараты на основе глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы. Унифицированный способ получения полиакриламидных гранул позволил качественно и количественно увеличить сорбционную емкость препарата. Применение метода эмульсионной полимеризации, при котором водорастворимые антигены фиксируются в пространственную решетку полиакриламидного геля методом "механического" включения без образования ковалентных связей, дает возможность сохранить антигены в максимально нативном состоянии, а иммобилизация биологически активных веществ в поверхностном слое "двойной" гранулы создает высокую концентрацию антигена именно в реакционно-активной зоне, что значительно повышает чувствительность ИФА. Включение магнитного материала производилось с целью ускорить и упростить ряд операций в твердофазных методах анализа, улучшить качественные характеристики определений и увеличить число обрабатываемых проб, что создает необходимые условия для разработки автоматизированных систем диагностики.
Таким образом, в результате проведенных исследований были разработаны и применены в варианте твердофазного иммуноферментного анализа иммобилизированные гранулированные препараты с магнитными свойствами на основе глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы. С их помощью нам удалось продемонстрировать определенную диагностическую ценность исследования АТ к ГР и СОД при ССД. Систематизация накопленных знаний об антителообразовании к ГР и СОД и другим энзимам этой системы, возможно, позволит в дальнейшем разработать иммуноферментный тест на основе ИГАП, улавливающий минимальные отклонения в содержании специфических антител к большинству ферментов АОС. Это значительно упростит диагностику и дифференциальную диагностику ревматических заболеваний, и прольет свет на общие механизмы их патогенеза.
Коррекция начинающихся нарушений функционирования АОС препаратами, подавляющими окислительные процессы, в совокупности с антифиброзными, сосудистыми препаратами, иммуносупрессивной терапией, плазмаферезом и иммуносорбцией позволит достигать стойкой ремиссии заболевания в более короткие сроки, что приведет к повышению продолжительности и качества жизни больных ССД.
ВЫВОДЫ
1. Применение иммобилизированной формы глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы в непрямом варианте иммуноферментного метода анализа позволило впервые выявить антитела к данным ферментам у больных системной склеродермией.
2. Максимальные значения сывороточных антител к глутатионредуктазе и супероксиддисмутазе отмечены при высокой активности системной склеродермии. Они наиболее часто обнаруживаются в терминальной стадии заболевания и при вовлечении в патологический процесс сердечно-сосудистой системы и легких.
3. Снижение показателей ферментативной активности глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы при одновременном повышении уровня антител к ней выявляется у больных системной склеродермией с умеренной и высокой степенью активности патологического процесса, что позволяет использовать этот критерий в комплексной оценке патологического процесса как неблагоприятный прогностичекий фактор.
4. Применение на стационарном этапе лечения больных системной склеродермией иммуносупрессивных препаратов и особенно методов экстракорпоральной терапии (плазмаферез) приводит к значительному снижению уровня антител к глутатионредуктазе и супероксиддисмутазе.
5. Уровень антител к глутатионредуктазе и супероксиддисмутазе может служить дополнительным критерием активности системной склеродермии и использоваться для оценки эффективности проводимой терапии наряду с традиционными клинико-лабораторными критериями.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Полученные иммобилизированные гранулированные антигенные препараты с магнитными свойствами на основе глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы рекомендуется использовать для выявления антител к ним у больных ССД в разработанном варианте иммуноферментного анализа.
2. При определении антител к глутатионредуктазе и супероксиддисмутазе иммуноферментным методом за норму следует считать показатели здоровых лиц - менее 0,124 и 0,114 е.о.п. соответственно.
3. Рекомендуется использовать определение уровня антител к ГР и СОД в сыворотке крови как дополнительный лабораторный критерий активности системной склеродермии, а также для диагностики возможного вовлечения в патологический процесс сердца и легких.
4. При системной склеродермии наряду с общепринятыми клинико-лабораторными показателями следует использовать определение уровня антител к ГР и СОД в сыворотке крови в качестве дополнительного критерия эффективности проводимой терапии.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ
Александров А.В., Гонтарь И.П., Ненашева Н.В., Емельянов Н.Н., Новикова О.В., Маслакова Л.А., Емельянова О.И.. Проблемы диагностики хронических иммуновоспалительных заболеваний: применение иммунологических исследований для выделения субтипов ревматоидного артрита // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т.9, №3. - С.333-334.
Александров А.В., Алехина И.Ю., Шилова Л.Н., Емельянова О.И., Маслова-Сорокина Е.В., Емельянов Н.Н. Роль аутоантител к ксантиноксидазе в развитии иммунопатологических реакций при воспалительных ревматических заболеваниях // Аллергология и иммунология, 2009, Т.10, №2. - С.220.
Шилова Л.Н., Гонтарь И.П., Зборовская И.А., Новикова О.В., Емельянов Н.Н. Клинико-патогенетическое значение наличия антител к ферментам антиоксидантной системы при синдроме Рейно // Клиническая медицина - 2010. - №2. - С.43-46.