Клиническая значимость ключевых маркеров ангиогенеза, апоптоза и системы активации плазминогена в сыворотке крови и опухоли больных колоректальным раком - Автореферат

Изучить биохимические и иммуногистохимические особенности экспрессии ММР-9 в первичных опухолях больных раком толстой кишки и в прилежащей к опухоли непораженной слизистой оболочке. Провести иммуноферментное определение молекулярнобиологических маркеров неоангиогенеза (VEGF) и апоптоза (SFAS) в сыворотке крови больных раком толстой кишки и изучить корреляцию биохимических показателей с основными клинико-морфологическими параметрами заболевания. При этом, частота выявления высокой экспрессии белка достоверно повышалась до 80% у больных при метастазах в печени, при низкой степени дифференцировки опухоли (80%) и при наличии инвазии опухоли в кровеносных сосудах (82,4%). У 57,2% больных раком толстой кишки выявлена низкая экспрессия коллагена IV типа в опухоли, причем частота выявления низкой экспрессии белка достоверно повышалась у пациентов с метастазами в печени (85%), при низкой степени дифференцировки опухоли (76%), при выраженной глубине инвазии в стенку кишки (75%), а также при наличии инвазии клеток рака в кровеносные сосуды (86,3%). Причем, достоверно более высокое содержание VEGF выявлено в сыворотке крови больных при местнораспространенной и IV стадии колоректального рака, тогда как концентрация VEGF у больных раком толстой кишки при I и Па стадиях опухоли не отличалась от содержания маркера у практически здоровых людей.В исследование включено 187 больных раком толстой кишки в возрасте от 34 по 79 лет, проходивших обследование и лечение в ГУ РОНЦ им. Из 187 больных раком толстой кишки у 124 (66,3%) пациентов наблюдали железистый вариант строения опухоли, у 43 (23,0%) преобладали папиллярные структуры, у 7 (3,7%) выявлен трабекулярный вариант строения аденокарциномы, у 13 (7%) опухоль была представлена солидными или солидно-альвеолярными структурами. Опухоли больных раком толстой кишки имели различную глубину инвазии в кишечную стенку: прорастание слизистого и подслизистого слоев наблюдали у 6 (3,2%) больных, врастание опухоли в мышечную оболочку у 21 (11,2%) пациента, прорастание всех слоев стенки кишки у 61 (32,6%) больного, опухоль прорастала все слои и врастала в жировую клетчатку 87 (46,5%) пациентов. Для иммуногистохимического окрашивания образцы тканей рака толстой кишки и пограничных с опухолью участков слизистой оболочки толстой кишки фиксировали в 10% забуференном формалине (РН 7.2), проводили по спиртам и ксилолам, заливали в парафин и готовили серийные срезы толщиной 3-5 мкм, которые наносили на стекла с адгезивным покрытием (Polysine Menzel-Glaser). Отметим, что высокая экспрессия ММР-9 выявлена достоверно чаще в опухоли пациентов при IVB стадии рака толстой кишки (в 2 раза), при солидном и солидно-альвеолярном гистологическом варианте строении опухоли (в 2 раза), при низкой степени дифференцировки опухоли (в 4 раза), при прорастании опухолью всех слоев стенки кишки и врастании в жировую клетчатку (в 1,7 раза чаще), при наличии инвазии опухоли в сосуды (в 4 раза).При иммуногистохимическом исследовании в 48,7% опухолей толстой кишки выявили высокий (неблагоприятный) уровень экспрессии ММР-9, при этом частота выявления высокой экспрессии маркера в опухоли достоверно повышалась: при IVB стадии заболевания (80,0%), при низкой степени дифференцировки опухоли (80,0%), при наличии инвазии опухоли в кровеносные сосуды (82,4% больных). Выявлено достоверное снижение показателей выживаемости среди больных раком толстой кишки с высокими уровнями экспрессии ММР-9 в опухоли по сравнению с низким содержанием фермента: общая 5-летняя выживаемость примерно в 3 раза, а безрецидивная выживаемость в 1,5 раза. Обнаружили низкий (неблагоприятный) уровень экспрессии коллагена IV типа в опухоли 57,2% больных раком толстой кишки, при этом частота выявления низкой экспрессии белка достоверно повышалась: при IVB стадии заболевания (85,0%), при низкой степени дифференцировки опухоли (76,0%), при большой глубине инвазии опухоли в кишечную стенку с прорастанием всех слоев и врастанием в жировую клетчатку (75,0%), при наличии инвазии опухоли в сосуды (86,3% больных). Показатель общей 5-летней выживаемости больных раком толстой кишки был достоверно ниже (примерно в 3 раза) при низкой экспрессии коллагена IV типа в опухоли, по сравнению с пациентами с высокой экспрессией маркера, а безрецидивная 5-летняя выживаемости достоверно не различалась между этими группами больных. Обнаружен, достоверно высокий исходный уровень ключевого активатора неоангиогенеза VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки (медиана 700 пг/мл) относительно группы контроля (медиана 301 пг/мл), при этом концентрация маркера достоверно повышалась: при IV стадии заболевания по сравнению с I и Па стадиями (показатели не отличались от группы контроля), при низкой степени дифференцировки опухоли по сравнению с высокой, при увеличении глубины инвазии опухоли в кишечную стенку, достигая максимальных значений при врастании в жировую клетчатку и при наличии инвазии опухоли в сосуды.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

При иммуногистохимическом исследовании в 48,7% опухолей толстой кишки выявили высокий (неблагоприятный) уровень экспрессии ММР-9, при этом частота выявления высокой экспрессии маркера в опухоли достоверно повышалась: при IVB стадии заболевания (80,0%), при низкой степени дифференцировки опухоли (80,0%), при наличии инвазии опухоли в кровеносные сосуды (82,4% больных).

Выявлено достоверное снижение показателей выживаемости среди больных раком толстой кишки с высокими уровнями экспрессии ММР-9 в опухоли по сравнению с низким содержанием фермента: общая 5-летняя выживаемость примерно в 3 раза, а безрецидивная выживаемость в 1,5 раза.

Обнаружили низкий (неблагоприятный) уровень экспрессии коллагена IV типа в опухоли 57,2% больных раком толстой кишки, при этом частота выявления низкой экспрессии белка достоверно повышалась: при IVB стадии заболевания (85,0%), при низкой степени дифференцировки опухоли (76,0%), при большой глубине инвазии опухоли в кишечную стенку с прорастанием всех слоев и врастанием в жировую клетчатку (75,0%), при наличии инвазии опухоли в сосуды (86,3% больных).

Показатель общей 5-летней выживаемости больных раком толстой кишки был достоверно ниже (примерно в 3 раза) при низкой экспрессии коллагена IV типа в опухоли, по сравнению с пациентами с высокой экспрессией маркера, а безрецидивная 5-летняя выживаемости достоверно не различалась между этими группами больных.

Обнаружен, достоверно высокий исходный уровень ключевого активатора неоангиогенеза VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки (медиана 700 пг/мл) относительно группы контроля (медиана 301 пг/мл), при этом концентрация маркера достоверно повышалась: при IV стадии заболевания по сравнению с I и Па стадиями (показатели не отличались от группы контроля), при низкой степени дифференцировки опухоли по сравнению с высокой, при увеличении глубины инвазии опухоли в кишечную стенку, достигая максимальных значений при врастании в жировую клетчатку и при наличии инвазии опухоли в сосуды.

Показатели выживаемости больных раком толстой кишки достоверно снижались при высоких исходных уровнях VEGF в сыворотке крови (800 пг/мл и более) по сравнению с низкими его значениями (менее 400 пг/мл), а общая 5-летняя выживаемость составила 46,2±6,2% и 80,1±9,1%, соответственно, при этом 5-летняя безрецидивная выживаемость снизилась в 2,5 раза.

Наряду с увеличением концентрации VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки обнаружено достоверное повышение в опухоли уровня неблагоприятно высокой экспрессии ММР-9 и одновременно низкая экспрессия коллагена IV типа.

Обнаружено более частое выявление SFAS в сыворотке крови больных раком толстой кишки (57,8%) по сравнению с практически здоровыми людьми (28,6%), а содержание маркера было достоверно выше у больных (медиана 9,1 нг/мл), чем в контроле (медиана 0,9 нг/мл). При этом показатели SFAS были тесно связаны с основными клинико-морфологическими характеристиками болезни и достоверно повышались при неблагоприятной высокой экспрессии белков ММР-9 и низкой экспрессии коллагена IV типа в опухоли (медианы 10,4 и 10,0 нг/мл, соответственно).

При высоком исходном уровне SFAS в сыворотке крови больных раком толстой кишки (10 нг/мл и более) выявлены достоверно низкие показатели выживаемости: общая 5-летняя выживаемость составила 37,6±7,1% (медиана 25,4 мес.), а безрецидивная (медиана 18,0 мес.).

Содержание активатора плазминогена урокиназного типа (UPA) и его ингибитора (PAI-1) в ткани опухоли больных раком толстой кишки было достоверно выше, чем в неизмененной слизистой оболочке толстой кишки. Их уровни достоверно повышались: при IV стадии болезни, при низкой степени дифференцировки опухоли и ее прорастании всех слоев стенки кишки, при наличии инвазии опухоли в сосуды, а также при неблагоприятно высоких уровнях экспрессии ММР-9 и низком содержании коллагена IV типа.

Общая 5-летняя выживаемость больных раком толстой кишки достоверно уменьшалась: при значениях UPA в ткани опухоли более 0,85 нг/мг белка (47,8±4,7%, медиана 58,9 мес.); при значениях PAI-1 более 0,5 нг/мг белка (44,3±5,0%, медиана 39,1 мес.), при значениях TPA менее 2 нг/мл (44,1±5,4%, медиана 38,8 мес.). Безрецидивная выживаемость больных раком толстой кишки достоверно различалась при пороговых значениях маркеров, которые составляли: для UPA 3 нг/мг белка; для TPA 2 нг/мг белка; для PAI-1-2 нг/мг белка.

Установлены наиболее значимые комбинации маркеров, сочетания которых указывают на: неблагоприятный прогноз общей выживаемости - ММР9/коллаген IV типа, MMP-9/UPA, MMP-9/PAI-1, коллаген IV типа/PAI-l; высокий риск развития отдаленных метастазов MMP-9/SFAS.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

На основе анализа некоторых молекулярнобиологических характеристик опухоли определены критерии для выявления наиболее прогностически неблагоприятных случаев и предрасположенности больных колоректальным раком к развитию метастазов. Так, показатели общей выживаемости больных колоректальным раком при высоком уровне экспрессии ММР-9 в первичной опухоли в 3 раза достоверно ниже, чем при низкой экспрессии белка, а 5летняя безрецидивная выживаемость пациентов ниже в 1,5 раза. Показатели общей 5-летней выживаемости больных раком толстой кишки зависели от уровня исходной концентрации ключевого активатора неоангиогенеза VEGF в сыворотке крови и при высоких его значениях (от 800 пг/мл и более) они были достоверно ниже, чем при значении VEGF менее 400 пг/мл. При этом, высокий уровень экспрессии ММР-9 в первичной опухоли больных колоректальным раком был связан с повышенными исходными уровнями VEGF в сыворотке крови. Общая 5-летняя выживаемость больных колоректальным раком при уровнях SFAS в сыворотке крови от 10 нг/мл и более была достоверно ниже. Кроме того, обнаружено, что безрецидивная выживаемость больных раком толстой кишки достоверно различалась между больными по пороговому уровню 3 нг/мг белка для UPA, 2 нг/мг белка для TPA и 2 нг/мг белка для PAI-1. Многофакторный анализ выявил наиболее неблагоприятные сочетания маркеров при оценке общего прогноза рака толстой кишки: ММР9-коллаген IV типа, MMP-9-UPA, MMP-9-PAI-1, коллаген IV типа-PAI-l и при прогнозе отдаленных метастазов MMP-9-SFAS.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Иммуногистохимическое исследование экспрессии Е-кадгерина, ?-катенина и CD44v6 в клетках первичного рака толстой кишки и его метастазов // Архив патологии. - 2005. - том 67, №6 c.34-38.

2. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Экспрессия молекул клеточной адгезии Е-кадхерина, b-катенина и CD-44v6 в первичных опухолях и метастазах аденокарциномы толстой кишки // БЭБМ. 2005. том 139, №6. с.675-679.

3. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Экспрессия молекул клеточной адгезии в первичных опухолях и метастазах рака толстой кишки // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологии» (Барнаул, 7-8 июня 2005 г.). - Барнаул. - 2005. с.219-220.

4. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Экспрессия молекул клеточной адгезии в метастазах аденокарциномы толстой кишки // В материалах VI Всероссийского съезда онкологов (Ростов-на-Дону, 9-14 октября 2005г.). Ростов-на-Дону 2005. с.303.

5. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Экспрессия молекулярнобиологических факторов прогноза и метастазирования при раке толстой кишки // В материалах II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г.). М. 2005. с.115.

6. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Прогностическая значимость молекул межклеточной адгезии при раке толстой кишки // В материалах XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006г.). М. 2006. с.116.

7. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Гольдберг В.Е., Кушлинский Н.Е. Иммуногистохимическое исследование межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий в аденокарциномах толстой кишки // Сибирский онкологический журнал. - 2006. № 3(19). с.99.

8. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Прогностическая значимость молекул межклеточной адгезии при раке толстой кишки // В тезисах международной научно-практической конференции «Ведущий многопрофильный госпиталь страны: основные функции, достижения и направления развития» (Москва, 1-2 июня 2006г.) // Вопросы клинической онкологии и онкогематологии. М. 2006. том 1-2, №6. с.169.

9. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Значение системы межклеточной и клеточно-матриксной адгезии в метастазирующих аденокарциномах толстой кишки // В материалах Российской научно-практической конференции с международным участием: «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи» (Барнаул, 4-5 июля 2006г.). - Барнаул. -2006. с.182-183.

10. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Молекулярные маркеры инвазии и метастазирования при раке толстой кишки // В материалах IV съезда онкологов и радиологов СНГ (Баку, 28 сентября 1 октября 2006г.). - Баку. - 2006. с.41.

11. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Особенности экспрессии матриксных металлопротеиназ в аденокарциномах толстой кишки и их метастазах // В материалах Х Российского онкологического конгресса (Москва, 21-23 ноября 2006г.). М. 2006. с.217.

12. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Молекулы межклеточной адгезии как факторы инвазии и метастазирования при раке толстой кишки // Молекулярная медицина. 2007. №1 с.50-54.

13. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Прогностическая значимость экспрессии матриксных металлопротеиназ в аденокарциномах толстой кишки и их метастазах // БЭБМ. 2007. - том 143, №4. с.434-438.

14. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Роль компонентов базальных мембран в процессе метастазирования аденокарцином толстой кишки // В материалах XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г.). - М. 2007. - с.85.

15. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Влияние матриксных металлопротеиназ на инвазивно-метастатический потенциал клеток рака толстой кишки // В материалах XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г.). - М. 2007. - с.85-86.

16. Герштейн Е.С., Короткова Е.А., Щербаков А.М., Пророков В.В., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Матриксные металлопротеиназы 7 и 9 и их тканевые ингибиторы 1 и 4 типа в опухолях и плазме крови больных раком толстой кишки // БЭБМ. 2007. - том 143, №4. с.438-442.

17. Делекторская В.В., Кушлинский Н.Е., Головков Д.А. Молекулярные маркеры инвазии и особенности прогноза рака толстой кишки // Тезисы докладов в материалах XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 14-18 апреля 2008г.). М. 2008. с.395.

18. Делекторская В.В., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Прогностическая значимость содержания белка nm23 в опухолях больных раком толстой кишки // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии.-2008.-№5.-с.35-41.

19. Делекторская В.В., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Иммуногистохимические, биохимические и ультраструктурные особенности метастазирующих аденокарцином толстой кишки // Клиническая лабораторная диагностика.-2008.-№9.-с.19-20.