Клеточные и тканевые реакции развивающегося головного мозга млекопитающих на воздействия неблагоприятных факторов среды - Автореферат

В специальной литературе имеются свидетельства того, что различные стрессовые воздействия, связанные с эмоциональными нагрузками или воздействиями неблагоприятных факторов среды во время беременности, вызывают отклонения в строении отделов головного мозга, сопровождающиеся функциональными расстройствами ЦНС в постнатальном периоде развития. Воздействие на плод высокого уровня материнских эндогенных глюкокортикоидных гормонов при стрессе приводит, как показывают наблюдения у человека и экспериментальные исследования на животных, к снижению внимания и способности к обучению, склонности к депрессии, изменению в мотивационно-эмоциональной сфере, к нарушениям моторной активности, низкому порогу раздражительности, повышению страха и тревожности и т.д. Результаты недавних исследований показали, что воздействие синтетических глюкокортикоидов в пренатальный период приводит к нарушению развития некоторых отделов мозга, сокращению количества синапсов, а также вызывает задержку созревания нейронов, уменьшение массы всего мозга у потомства крыс (Muneoka K., Mikuni M., Ogava T. et al., 1997; Young N.A., Teskey G.C., Henry L.C., et al., 2006). Влияние различных форм гипоксии на строение и функции систем и органов достаточно хорошо изучено у взрослых животных, однако реакции клеток различных отделов развивающегося мозга в период раннего нейрогенеза на повреждающее действие гипоксии, а также структурные изменения формаций мозга у потомства в постнатальный период не исследованы. Изучение этих проблем требует проведения модельных экспериментов на животных, основное направление которых должно быть связано с исследованием влияния повреждающих факторов: повышенного уровня глюкокортикоидных гормонов, влекущего за собой изменение уровней содержания и метаболизма моноаминов, а также острой пренатальной гипоксии на развитие структур головного мозга, во время раннего постимплантационного периода, когда формируются закладки формаций головного мозга, и на стадиях их активного роста.

Полученные результаты диссертационного исследования опубликованы в 54 работах. Из них: 1 обзор, 2 монографии и 25 статей в ведущих отечественных и зарубежных журналах, включенных в список ВАК.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материал и методы», четырех глав результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы. Диссертация изложена на 300 страницах, иллюстрирована 124 рисунками, включающими 215 микрофотографий, 9 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования. Работа выполнена на мышах гибридах F1 (C57BL/CBA), мышах линии C57BL и лабораторных крысах линии Wistar. Было исследовано 75 зародышей, находящихся на разных стадиях дробления (от стадии 2-х бластомеров до стадии бластоцисты); 126 эмбрионов на ранних постимплантационных стадиях развития (с 6-7 до 16 эмбриональных суток); 238 плодов на поздних постимплантационных стадиях развития (с 17 до 19 эмбриональных суток); 376 животных на разных стадиях постнатального развития (новорожденных, особей раннего постнатального периода, препубертатного, пубертатного периодов и животных, достигших половозрелого возраста).

Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Эмбрионы различных стадий пренатального развития и животные разных постнатальных этапов онтогенеза в работе использовались для изучения: 1. Роли серотонина в процессах дробления. Были использованы доимплантационные дробящиеся зародыши со стадии 2-х бластомеров до стадии бластоцисты. Оценивали скорость дробления, сопоставляя количество бластомеров в зародыше в опыте и контроле на определенных стадиях.

2. Воздействий неблагоприятных факторов среды (повышенного уровня глюкокортикоидов, гипоксии) на развитие разных отделов развивающегося головного мозга. Исследование закладок неокортекса, среднего, заднего и продолговатого мозга у постимплантационных эмбрионов и плодов проводили на 13, 14, 16, 17, и 19, 20 эмбриональные сутки, т.е. в периоды активных процессов пролиферации, миграции и начальной дифференциации нейронов. Определяли наличие клеток с признаками пикноза, либо апоптотической гибели, а также целостность ядра и цитоплазмы.

3. Отдаленных последствий пренатальных воздействий повреждающих факторов среды (повышенного уровня глюкокортикоидов, пониженного уровня серотонина, гипоксии). В разные сроки постнатального периода исследовали различные отделы головного мозга, отличающиеся по происхождению, строению и реализации высших нервных функций: neocortex (слои II - VI); структуры, входящие в состав лимбической системы: area cingularis (передняя и задняя подобласти лимбической коры); hippocampus (поля СА1, САЗ, СА4 и fascia dentata); моноаминергические ядра - substantia nigra и nucleus raphe dorsalis.

Сравнительный анализ состояния структур головного мозга после различных воздействий и в контроле проводили в стандартизированных условиях на одних уровнях. При этом использовался стереотаксический атлас мозга крысы (Paxinos G., Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, 1998); и стереотаксический атлас мозга мыши (Slotnick B. M., Leonard C.M. A Stereotaxic Atlas of the albino mouse forebrain, 1995).

Материал обрабатывали по общепринятой гистологической методике. Готовили серийные фронтальные срезы целого мозга. Морфологическому анализу подвергали каждый 5-й срез разных отделов мозга.

Были исследованы следующие отделы головного мозга: neocortex- фронтальная (area frontalis); теменная (area parietalis); височная (area temporalis); затылочная кора (area occipitalis); лимбическая кора (area cingularis), формации hippocampus (поля СА1, СА2, САЗ, СА4 и fascia dentata); substantia nigra и nucleus raphe dorsalis. Оценивали размер нейронов, их форму, целостность ядра и цитоплазмы, наличие клеток с признаками пикноза или цитолизиса, вакуолизации цитоплазмы, а также оценивали плотность расположения нейронов в каждой структуре.

Выбранные для исследования структуры мозга выполняют жизненно важные функции, принимают участие в построении и регуляции многочисленных и разнообразных функций ЦНС, участвуют в ответе на стрессовые ситуации, достаточно обильно иннервируются серотонинергическими волокнами.

Методы исследования.

Проведено несколько серий экспериментов: 1. Изучение воздействия повышенного уровня глюкокортикоидов, возникающего после стресса матери на развивающийся мозг крыс.

Изучались как непосредственные реакции развивающейся нервной ткани в ответ на материнский стресс, так и отдаленные его последствия. Самки подвергались процедуре хронического иммобилизационного стресса в течении 30 минут дважды в день на 16, 17, 18, 19, 20 и 21 сутки беременности. Исследование непосредственных реакций эмбриональной нервной ткани в ответ на стресс матери проводили через 3 часа и 1 сутки после однократного воздействия материнского стресса на эмбрионы 16 суток развития. Для изучения отдаленных последствий хронического материнского стресса мозг потомства фиксировали на 25, 40-45 и 90 сутки постнатального развития. В качестве контроля исследовали мозг потомков аналогичных стадий развития, полученных от интактных матерей.

2. Изучение воздействия повышенного уровня глюкокортикоидов, возникающего у беременных самок крыс после введения синтетического аналога дексаметазона на развивающийся мозг потомства.

Изучали как непосредственные реакции развивающейся нервной ткани на воздействие дексаметазона в пренатальный период развития, так и отдаленные его последствия. В исследовании использовали фармакологический синтетический препарат - дексаметазон-фосфат (КРКА, Словения) в дозах 1 мг/кг и 3 мг/кг. Выбор дозы: 1мг/кг - приближена к средне терапевтической, используемой в акушерской практике; 3 мг/кг - широко используется в известной литературе в экспериментах на животных для более выраженного эффекта воздействия повышенного уровня кортикоидов на функции мозга. Препарат вводили однократно внутрибрюшинно на 13, 16 и 19 сутки внутриутробного развития, когда наиболее активно осуществляются процессы пролиферации нейральных клеток-предшественников и их начальная дифференцировка. Для исследования непосредственных реакций эмбриональной нервной ткани на воздействие дексаметазона мозг плодов крыс линии Wistar фиксировали через 3 часа и 1 сутки после введения препарата. Для изучения отдаленных последствий пренатального воздействия дексаметазона мозг потомков фиксировали на 60 сутки постнатального развития, когда отчетливо выявляются модификации основных гистогенетических процессов. В качестве контроля исследовали мозг потомков аналогичных стадий развития, полученных от интактных матерей, и матерей, получавших однократную внутрибрюшинную инъекцию физиологического раствора.

3. Изучение роли серотонина в развитии и фомировании головного мозга у подопытных животных.

Для исследования участия серотонина в развитии головного мозга и формирования патологий при его дефиците в пренатальном периоде использовался метод ингибирования ключевого фермента его синтеза - триптофангидроксилазы парахлорфенилаланином (ПХФА). Работа выполнялась на мышах гибридах F1(C57Bl/CBA), на мышах линии C57Bl и крысах линии Wistar. Беременным самкам мышей (на 8 эмбриональные сутки) и крыс (на 9 эмбриональные сутки) вводили ПХФА однократно внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг. Доза была выбрана с учетом литературных данных, свидетельствующих о том, что ПХФА в дозе 300-400 мг/кг как у взрослых животных, так и у их плодов вызывает длительное снижение уровня содержания серотонина (до 50-80%). Снижение уровня серотонина происходит постепенно, достигает максимума через 3-е суток и сохраняется пониженным в течение 5-6 суток (Науменко, Е.В., 1971; Попова Н.К. и др., 1975; Keller H.H., 1972; Lauder J.M. et al., 1985)

Метод определения уровня серотонина. Уровень содержания серотонина в тканях мозга эмбрионов определяли методом высокоаффинной жидкостной хроматографии в лаб. Биохимии НИИ Акушерства и гинекологии им. С.Е. Отта. Количество серотонина измеряли в нг/1мг белка эмбриональной нервной ткани. Было установлено, что в пробах, полученных от интактных эмбрионов, количество серотонина составляло 0,137±0,01 нг/мг белка, а через 3 суток после введения ПХФА в дозе 400 мг/кг его количество равнялось 0,05±0,006 нг/мг белка эмбриональной нервной ткани, т.е. снижалось на 63,3%.

Для изучения влияния дефицита серотонина на развитие доимплантационных и ранних постимплантационых зародышей препарат вводили на 1 и 2 сутки беременности. Эмбрионы исследовали на 3, 4, 5, 7 и 8 эмбриональные сутки развития.

Для изучения роли серотонина в развитии головного мозга ПХФА вводили самкам мышей на 8 сутки, а самкам крыс на 9 сутки беременности. Эта стадия эмбрионального развития была выбрана из расчета, что значительное снижение уровня серотонина происходило через 3 суток (см. выше) после введения (т.е. на 11-12 эмбриональные сутки, в период когда формируются отделы мозга) и остается пониженным до 16-18 эмбриональных суток (т.е. на протяжении всего периода активного морфогенеза: процессов пролиферации, миграции и начальной дифференцировки нейронов). Исследование головного мозга у животных проводили в постнатальный период на 1, 5,10, 25, 40 и 90 (П1, П5, П10, П25, П40 и П90) постнатальные сутки. В качестве контроля использовали мозг потомков соответствующих стадий развития, полученных от интактных матерей, и матерей которым вводили физиологический раствор на соответственных сроках беременности.

Для изучения влияния пренатального материнского стресса на формирование отделов мозга у эмбрионов, развивающихся на фоне дефицита серотонина, использовали одновременное сочетание метода пренатального ингибирования синтеза серотонина и пренатального иммобилизационного стресса. Этот фрагмент работы выполнен на крысах линии Wistar. В качестве контроля служили самки, которым однократно внутрибрюшинно на соответствующей стадии вводили физиологический раствор. Исследование отделов головного мозга у потомства как контрольных самок, так и самок, подвергавшихся воздействиям проводили на 25, 40 и 90 постнатальные сутки.

Морфометрические параметры клеток измерялись в разных слоях neocortex и hippocampus. Определяли количество клеток, их среднюю площадь, процент площади, занимаемой клетками внутри выделенного квадрата, вертикальные и горизонтальные размеры, углы наклона клеток или угол отклонения апикального дендрита от вертикали при нарушении ориентации нейронов. Количественную оценку наблюдаемых изменений проводили с помощью компьютерной программы анализа изображений Matrox Inspector (Канада). Изображения структур с гистологических срезов мозга животных вводили в компьютер с помощью цветной цифровой видеокамеры Leica DIC-E 300F (Leica, Germany), смонтированной на световой микроскоп Н605Т (увеличение х40; Image size 1300x1030 пикселей; Color depth: 8 bit). Сравнение количественных данных проводили с использованием параметрического критерия t.

Статистическая обработка количественных оценок и измерений проводилась при помощи компъютерной программы PHOTOM121.

Для электронномикроскопического исследования участки neocortex фиксировали методом погружения в 2,5% растворе глутаральдегида на фосфатном буфере, затем отмывали в буфере и использовали дополнительную фиксацию 1% четырехокисью осмия на 0, 05М какодилатном буфере, обезвоживали в спиртах и заливали в эпон. Изготавливали полутонкие срезы, проводили прицельную заточку блока на уровни различных слоев neocortex. Ультратонкие срезы исследовали под электронным микроскопом Jem-100 B.

4. Влияние острой пренатальной гипоксии на развитие мозга крыс.

Исследование проведено на крысах линии Wistar. Беременных крыс помещали в барокамеру СВК-150 объемом 14 литров. Барокамера оснащена устройствами для автоматического обогрева до заданной температуры, постоянной смены газовой смеси и определения скорости потока газа. Во время экспериментов использовали аппаратуру для определения: содержания О? и СО? - газоанализатор CF-101 (SPHAJA, Франция), скорости газового потока через камеру - волюметр (VEB-MLW, Германия), давления в камере - манометр с ценой деления 1 кг/см? (Россия), температуры среды в камере - электротермометр и чернильный самописец КСП -6 (Россия). Азотно-кислородную смесь приготавливали с помощью газоаналитической и газосмесительной установки фирмы “Laorg” (Франция). Беременных самок помещали в барокамеру и содержали в ней 1 час, в течение которого ее продували азотно-кислородной смесью со скоростью 2,5 л/мин. Во время экспериментов использовали следующие параметры среды: содержание кислорода - 7,56 - 7,8%; содержание углекислого газа 0,16 - 0,21%; температура - 21,3 - 23,0?С; общее давление - нормальное. Воздействие гипоксии осуществляли на 13, 16 и 19 сутки эмбрионального развития. Гистологическое исследование мозга крысят проводили на 1, 5 и 10 постнатальные сутки. Мозг фиксировали в жидкости Буэна и по общепринятой методике заливали в парафин, готовили фронтальные срезы толщиной 5-7 мкм и окрашивали по Нисслю.

Материал для световой микроскопии обрабатывался общепринятыми гистологическими методами. Гистологические препараты исследовали под световым микроскопом фирмы Leica (Германия).

Иммуноцитохимические методы исследования.

Метод выявления GFAP. Изучение дифференцировки астроцитарных элементов в разных кортикальных структурах проводили с использованием иммуноцитохимического метода выявления белка промежуточных филаментов астроцитов - специфического глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), что позволило судить о начале, объеме и темпах их дифференцировки. Материал фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 1 часа или смеси 80% этанола и 0,5% параформальдегида в течение 24 часов. GFAP выявляли с помощью поликлональных антител (DAKO, Дания) и вторичных антител, конъюгированных с полимером и пероксидазой (En Vision , DAKO, Дания). Визуализацию связанных первичных антител производили при помощи хромогена DAB (DAKO, Дания).

Метод выявления серотонина. Для выявления серотонинергических нейронов nucleus raphe dorsalis использовали иммуноцитохимический метод выявления серотонина. Материал фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,01М фосфатно-солевом буфере (РН=7,4) в течение 24 часов. Фиксированный материал обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике. Иммуноцитохимическая реакция на серотонин осуществлялась с использованием поликлональных кроличьих антител к серотонину фирмы Novocastra (NCL-SERTP, разведение 1: 200) и набора LSAB -2 (DAKO, Дания). Визуализацию связанных первичных антител производили при помощи хромогена DAB (DAKO, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали толуидиновым синим по Нисслю.

Метод выявления тирозингидроксилазы. Для изучения локализации тирозингидроксилазы, использовали иммуноцитохимический метод ее выявления. Материал фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,01М фосфатно-солевом буфере (РН=7,4) в течение 24 часов. Фиксированный материал обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике. Иммуноцитохимическая реакция на тирозингидроксилазу осуществлялась с использованием моноклональных антител (клон ТОН А1, разведение 1: 500) фирмы BD Pharmingen и набора LSAB -2 (DAKO, Дания). Визуализацию связанных первичных антител производили при помощи хромогена DAB (DAKO, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали толуидиновым синим по Нисслю (Коржевский Д.Э. и др., 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние иммобилизационного стресса матери на развитие отделов головного мозга крыс.

Уровень стероидных гормонов (глюкокортикоидов и половых) в крови матери имеет существенное значение для нормального развития плодов. Изменение гормонального баланса в ту или другую сторону, возникающего при воздействии разного рода стрессов на мать, как правило, приводит к существенным нарушениям различных функциональных систем ее потомков.

В развитии стресса существенная роль принадлежит глюкокортикоидам и серотонину, которые соответственно называют гормоном и медиатором стресса и уровень которых при этом значительно меняется. Результатом пренатального стресса является, в частности, изменение уровня серотонина и снижение его оборота в ряде структур головного мозга (Poland R.E., et al., 1995; Muneoka K. et al, 1997). Серотонин является одним из главных модуляторов гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, как матери, так и плода, участвующей в ответе на стресс. Попытка в настоящей работе изучить влияние дисбаланса кортикоидов и серотонина, возникающего при материнском стрессе, на развитие отделов головного мозга млекопитающих объясняется отсутствием в доступной нам литературе данных о клеточных механизмах, характере и тканевых характеристиках нарушений развития мозга.

Материнский стресс во время формирования отделов головного мозга вызывает каскад структурно-функциональных реакций, при этом выявляются непосредственные реакции эмбриональной нервной ткани на стресс и отдаленные его последствия, представленные структурными изменениями во всех исследованных формациях головного мозга и сохраняющиеся в постнатальном онтогенезе.

Непосредственные реакции эмбриональной нервной ткани в ответ на стресс матери.

Однократная процедура стрессирования матери на 16 сутки беременности достаточно быстро (через 3 часа и 1 сутки) вызывает реакцию развивающейся нервной ткани на стресс, которая приводит к апоптотической гибели часть клеток. В основном, гибель нейробластов регистрируется в развивающихся неокортексе, среднем и продолговатом мозге. Утрата части нейробластов в популяциях клеток последних, несомненно, будет сказываться на формировании и развитии структур этих отделов мозга и их клеточном составе.

Отдаленные последствия воздействия стресса матери в структурной организации отделов головного мозга у потомства крыс.

Аномальное развитие neocortex выявлено у животных, пренатально переживших материнский стресс, на 25, 40 и 90 постнатальные сутки, при этом характерными нарушениями цитоархитектоники во всех изученных областях коры (area frontalis, area parietalis, area temporalis, area occipitalis) было: истончение и разреженность всех слоев, особенно глубоких (V и VI), снижение в них количества клеток, в том числе, больших пирамидных нейронов, недоразвитие нейропиля, нарушение ядерно-цитоплазматического соотношения в нейронах, а также присутствие диффузной единичной гибели клеток во всех слоях neocortex. У животных, достигших половозрелого возраста (90 постнатальные сутки), все структурные изменения в neocortex, отмеченные в препубертатный и пубертатный периоды, сохраняются, более того к этому сроку происходит утрата больших пирамидных нейронов в слое V и появление нейронов с вакуолизированной цитоплазмой. Материнский стресс у животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина, приводит к аналогичным изменениям в кортикальных структурах.

Значительные нарушения выявлены в area cingularis. У потомков всех возрастов, пренатально перенесших материнский стресс, в передней и задней подобластях лимбической коры присутствуют аналогичные изменения характерные для neocortex (истончение и разреженность как слоев верхнего комплекса (II-III-IV), так глубоких слоев (V и VI), снижение количества клеток в слоях, уменьшение размеров клеточных тел и объема цитоплазмы). В задней лимбической подобласти эти нарушения более выражены. У крыс, развивавшихся на фоне дефицита серотонина и пренатально перенесших материнский стресс, в area cingularis наряду со сходными нарушениями, по мере увеличения постнатального возраста (в пубертатный период и у половозрелых животных), в верхних слоях (II-III-IV) задней лимбической подобласти происходит еще большее снижение количества нейронов, уменьшение размеров клеток и изменение их формы, часто приобретающей неправильные очертания.

Хронический стресс матери приводит у потомков к изменению структуры всех формаций hippocampus. В полях СА1, САЗ и СА4 слои пирамидных нейронов истончены. Единичные диффузно рассеянные погибшие пирамидные нейроны и клетки гранулярного слоя fascia dentata встречаются на протяжении всего постнатального периода, а также у животных, достигших половозрелого возраста. Такая отсроченная постепенная гибель клеток в результате приводит к утрате значительной части нейронов в формациях hippocampus у взрослых животных. Достаточно высокую чувствительность клеток hippocampus к кортикоидам, обнаруженную в нашем исследовании, по-видимому, можно объяснить содержанием самой высокой плотности глюкокортикоидных рецепторов нейронами всех формаций hippocampus по сравнению с клетками других структур головного мозга (Wan S.L., Liao M.Y., Sun K., 2002; Weinstock, 2005). Более того, их количество в лимбических областях еще более повышается после иммобилизационного стресса матери (Kanitz E., Otten W., Tuchscherer M., et al., 2003). Результатом этого может быть изменение функционального состояния нейронов в отделах hippocampus. Обнаруженные нами структурные изменения и дегенеративные процессы в формациях hippocampus могут быть одной из основных причин нарушения физиологических и поведенческих реакций у животных. Отмечено, что разного рода психические расстройства и неврологические заболевания: шизофрения, депрессия, эпилепсия, болезнь Альцгеймера и т.д., сопровождаются изменениями в структуре отделов hippocampus (Fujioka A., Fujioka T., Ishida Y., et al., 2006; Fenoglio K.A., Brunson K.L., Baram T.Z., 2006; Dhikav V., Anand K.S., 2007).

Отмеченное нами снижение количества пирамидных нейронов в формациях hippocampus следует расценивать как результат остановки пролиферации клеток во всех полях и fascia dentata hippocampus после пренатального стресса, вызывающей резкое уменьшение его объема (Isgor C., Kabbaj M., Akil H., 2004; Yu I.T., Lee S.H., LEEY.S., Son H., 2004). Наряду с этим выявлен факт присутствия в пубертатный период значительного количества незрелых клеток в hippocampus (Liu H., Kaur J., Dashtipour K., et al., 2003), который дает основание предположить, что после стрессового воздействия основная масса клеток не способна осуществить дифференцировку должным образом и остается в незрелом состоянии. Вероятно, последствием этого может быть отсроченная гибель клеток в этих структурах.

Показано, что у животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина и переживших пренатальный стресс, структурные изменения в формациях hippocampus более выражены. Во всех полях и, особенно, fascia dentata слои нейронов истончены, присутствуют диффузно рассеянные погибшие, как пирамидные нейроны, так и клетки гранулярного слоя. Взаимные контролирующие влияния серотонина и кортикоидов в нейрогенезе в период пренатального развития крайне мало изучены. Известно лишь то, что у пренатально стрессированных крыс происходит снижение уровня серотонина в hippocampus за счет подавления избыточным кортикостероном серотонинергической трансмиссии путем снижения экспрессии 5-НТА1 рецепторов. С другой стороны, серотонин через 5-НТ7 рецепторы вызывает транскрипцию MRNA глюкокортикоидных рецепторов в hippocampus (Andrews M.H., Kostaki A., Setiawan E., 2004), недостаток кортикостероидов нарушает развитие серотонинергической иннервации в hippocampus и neocortex (Leret M.L., Peinado V., Suarez L.M., et al., 2004). Как видно, существуют достаточно сложные механизмы тесного взаимодействия уровней серотонина и глюкокортикоидных гормонов, необходимых для нормального нейрогенеза и созревания мозга, нарушение корреляции уровней которых при материнском стрессе может приводить к аномалиям развития отделов мозга, что еще раз подтверждается результатами настоящего исследования.

Впервые показано, что материнский стресс сказывается на морфофункциональном состоянии нейронов моноаминергических ядер substantia nigra и nucleus raphe dorsalis. Структурные изменения и гибель клеток в них регистрируются в пренатальный и постнатальный (препубертатный, пубертатный) периоды, а также сохраняются у животных, достигших половозрелого возраста.

У 25 суточных крысят после пренатального стрессирования в substantia nigra zona compacta обнаружено снижение количества клеток, присутствие нейронов с вакуолизированной цитоплазмой (рис.1). С увеличением постнатального возраста (в пубертатный период и у половозрелых животных) происходит усиление дегенеративных процессов при этом возрастает количество нейронов, имеющих тяжелые изменения и погибших клеток, одновременно происходит сокращение общего количества нейронов, составляющих структуру. Оказалось, что у подопытных животных в пубертатный период количество дофаминсинтезирующих нейронов сокращается почти в 2 раза, вероятно, результатом этого будет снижение объема синтеза дофамина и его оборота в организме.

Рис. 1 Мозг крысы, фрагмент substantia nigra zona compacta на 25 постнатальные сутки, (а) контроль, (б) после пренатального стрессирования; вакуолизация цитоплазмы нейронов (стрелка). Окраска по Нисслю. Увел. ок.х 10, об.х 40

Более выраженные структурные изменения в substantia nigra zona compacta были выявлены в пубертатном периоде и у взрослых животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина и пренатально перенесших материнский стресс. Значительное сокращение количества нейронов, соответствующих норме, и увеличение клеток с тяжелыми изменениями ядра и цитоплазмы, а также погибших нейронов (рис.2) могут быть результатом нарушения формирования самой серотонинергической системы и снижения синтеза серотонина, мишенью которого являются дофаминергические нейроны, их развитие и дифференцировка, а, следовательно, и формирование substantia nigra в целом.

Регулирующие влияния дофамина в эмбриогенезе достаточно известны. Дифференцировка дофаминергических нейронов в substantia nigra zona compacta и становление проекций к развивающимся отделам мозга в норме происходит довольно рано (Hu Z., Cooper M., Crockett D.P., et al., 2004; Van Kampen J.M., Robertson H.A., 2005; Deng D.R., Djalali S., Holtje M., et al. 2007). Нарушение развития и интеграции дофаминергических проекций в конечный мозг, изменение становления

Рис. 2 Мозг крысы, substantia nigra zona compacta на 90 постнатальные сутки после пренатальной деплеции серотонина и стрессирования; вакуолизация цитоплазмы нейронов (короткая стрелка), сморщенные гиперхромные нейроны (длинная стрелка). Окраска по Нисслю. Увел. ок.х10; об.х 40 кортикостриатных и кортиколимбических путей, нарушение дофаминергической иннервации hippocampus после пренатального стресса (Berger M.A., Barros V.G., Sarchi M.I., et al, 2004; Scott S.A., Diaz N.M., Ahmad S.O., 2007) может, отчасти, объяснять обнаруженные в данном исследовании нарушения развития кортикальных структур и hippocampus.

В развитии дофаминергической системы принимает участие большое количество активных факторов (различные типы ростовых факторов, нейротрофины, представители семейства TGF-beta, IGFS, стероидные гормоны и т.д.), которые включаются в регуляцию развития и дифференцировки клеток этой нейральной системы. Механизмы, лежащие в основе этих процессов сложны, комплексны и включают взаимодействия с другими факторами, стимулирующими эти процессы, а также требуют активации ненейральных клеток, таких как астроциты. Одной из мишеней глиального нейротрофического фактора (GDNF) являются дофаминергические нейроны. Этот, один из самых мощных трофических факторов, способствует нормальной функции дофаминергических нейронов и их выживанию, однако эта специфическая его функция утрачивается в пубертатный период (Kholodilov N., Yarygina O., Oo T.F., et al., 2004; (.Li L., Su Y., Zhao C., et al., 2006; Kipp M., Karakay S., Pawlak J., et al., 2006). Не исключено, что обнаруженное в нашем исследовании нарушение глиогенеза после пренатального стресса, может вносить свой вклад в изменение структуры substantia nigra zona compacta и недостаточное поддержание жизнеспособности дофаминергических нейронов. Транскрипционные факторы, недавно выделенных генов (HNF3alpha, synaptotagmin 1 и Ebf3), экспрессия которых обнаружена в вентральном среднем мозге, являются необходимыми для постмитотической дифференцировки и выживания дофаминэргических нейронов. При этом их экспрессия продолжается до периода полового созревания (Thuret S., Bhatt L., O?Leary D.D., et al., 2004). Не исключено, что избыточный уровень кортикоидов, являющихся ядернотропными гормонами и воздействующими на плод после пренатального стрессирования, могут влиять на экспрессию этих генов, оказывая непрямое влияние на дифференцировку дофаминергических нейронов и их выживание. Обнаруженное в настоящем исследовании уменьшение размеров нейронов и их отсроченная гибель вполне могут быть результатом нарушения процесса дифференцировки нейронов. Более того, как видно из установленных фактов, экспрессия некоторых генов и функциональная активность нейротрофических факторов в развитии имеют место только до периода полового созревания. Учитывая, с одной стороны, прекращение функциональной активности некоторых нейротрофических факторов, а с другой, изменение гормонального фона, пубертатный период можно считать критическим для проявления и усугубления пренатально сформированных аномалий, что и подтверждают представленные нами данные.

Ранимость дофаминергической системы достаточно известна. Атрофию дофаминергических нейронов у взрослых могут вызвать воздействия таких повреждающих факторов как гипоксия, применение лекарственных препаратов (нейролептиков), воздействие химических веществ и т.д., а также возрастные изменения. Несмотря на большое число исследований, изучающих механизмы, лежащие в основе этих явлений, и использование различных моделей на животных, фундаментальный вопрос: когда происходят первичные нарушения, приводящие к атрофии дофаминергические нейроны, в раннем периоде развития, последующем онтогенезе или они связанны с возрастными изменениями, остается открытым. Однако существует мнение, что дегенеративные процессы в substantia nigra zona compacta у взрослых индивидуумов и в пожилом возрасте являются следствием патологических процессов, происходивших в более раннем онтогенезе (Lang A.E., 2007). Последствия материнского стресса в пренатальный период развития потомства могут являться первоначальной причиной, вызывающей нарушения белкового обмена, оксидативный стресс, увеличение содержания железа, измененние гомеостаза Са ?, т.е. выявленные факторы, приводящие к ускоренной утрате нейронов в substantia nigra zona compacta и нигростриатной дегенерации (Lang A.E., 2007). Причиной дофаминергической нейродегенерации в substantia nigra zona compacta может быть также окислительное повреждение нуклеиновых кислот (цитоплазматической RNA и митохондриальной DNA). Не исключено, что частичное распыление или полная утрата вещества Ниссля, а также вакуолизация цитоплазмы у части нейронов substantia nigra zona compacta, выявленные в настоящем исследовании после пренатального стрессирования, являются результатом окислительного повреждения нуклеиновых кислот, следствием которого, в свою очередь, является нарушение синтетических процессов. Важно отметить, что значительное количество общего продукта окисления нуклеиновых кислот (8-hydroxyguanosine) присутствует в цитоплазме нейронов substantia nigra zona compacta и соответствует распределению нейродегенерации у пациентов с болезнью Паркинсона (Zhang J., Perry G., Smith M.A., et al., 1999).

Рис. 3 Мозг крысы, nucleus raphe dorsalis на 25 постнатальные сутки, (а) контроль, (б) после пренатального стрессирования; вакуолизация цитоплазмы нейронов (короткая стрелка), сморщенные гиперхромные клетки (длинная стрелка), Окраска по Нисслю

Хронический пренатальный стресс является причиной значительного повреждения структуры nucleus raphe dorsalis. Обнаружены характерные нарушения: уменьшение размеров nucleus raphe dorsalis, снижение общего количества клеток, изменение соотношения разных типов нейронов. У животных в препубертатный период присутствуют клетки с вакуолизированной цитоплазмой, а также диффузная единичная гибель нейронов (рис.3). С увеличением постнатального возраста (в пубертатный период и у половозрелых животных) сокращается количество нейронов соответствующих норме, снижается число серотонинсинтезирующих нейронов и увеличивается число клеток, имеющих тяжелые изменения ядра и цитоплазмы, а также погибших. У животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина и пренатально перенесших материнский стресс, подобные нарушения более выражены, при этом в nucleus raphe dorsalis резко снижается число клеток синтезирующих серотонин. По мере увеличения постнатального возраста (90 суток) наблюдается усиление дегенеративных процессов, следствием которых является резкое уменьшение размеров nucleus raphe dorsalis ядра, количества в нем нейронов и, часто, его полное разрушение (рис.4). По-видимому, широко участвуя в механизмах стресса, сама серотонинергическая система является объектом воздействия гормонов стресса.

Рис. 4 Мозг крысы, nucleus raphe dorsalis, на 90 постнатальные сутки после пренатальной деплеции серотонина и стрессирования; снижение количества нейронов, (а) вакуолизация цитоплазмы, деформация ядер (короткая стрелка), погибшие нейроны (длинная стрелка); (б) опустошение структуры. Окраска по Нисслю. Увел. ок.х10; об.х40

Влияние синтетического глюкокортикоида дексаметазона на развитие отделов головного мозга крыс.

Широкий спектр морфофункциональных нарушений в отделах головного мозга крыс обнаружен после пренатального введения синтетического глюкокортикоида дексаметазона. Очевидным был как дозозависимый, так и стадиоспецифический эффект воздействия дексаметазона.

Наибольшие структурные нарушения в neocortex, а именно, истончение и разряжение слоев, снижение в них количества клеток, уменьшение размеров клеточных тел и объема цитоплазмы, гибель нейронов, выявлены при введении дексаметазона в обеих используемых дозах (1мг/кг и 3мг/кг) на более ранних и поздних постимплантационных стадиях (13 и 19 эмбриональные сутки), при этом чувствительность развивающегося neocortex к глюкокортикоидам на поздних сроках пренатального развития оказалась более высокой.

Значительные изменения в area cingularis обнаружены при введении дексаметазона в обеих дозах и на всех исследованных стадиях (13, 16 и 19 эмбриональные сутки). Полученные данные выявили отличия в степени повреждения подобластей лимбической коры, из которых задняя подобласть имеет более выраженные нарушения (истончение и разряжение всех слоев II-VI, резкое снижение в них количества клеток, уменьшение размеров клеточных тел и объема цитоплазмы). Наши данные интересно сопоставить в результатами, полученными другими авторами и показавшими, что пренатальное введение синтетических глюкокортикоидов (дексаметазона и бетаметазона) в дозах более низких, чем используются в клинике или эквивалентных им, имеет отдаленные эффекты и также приводит у крыс к уменьшению числа и размеров нейронов в неокортексе, нарушению пролиферации в субвентрикулярной зоне и гиппокампе ( Kreider M.L., Tate C.A., Cousins M.M., et al., 2006; Bruschettini M., van den Hove D.L., Gazzolo D., et al., 2006). Вероятно, нарушение или задержка процессов пролиферации клеток-предшественников после пренатального введения дексаметазона является причиной обнаруженных нами изменений в развитии формаций hippocampus. Об этом свидетельствует и значительное истончение слоев пирамидных нейронов в полях СА1, СА2, САЗ, СА4 и fascia dentata (рис.5,6). Известно, что эндогенные и синтетические глюкокортикоиды и серотонин влияют на экспрессию глюкокортикоидных рецепторов во время развития формаций hippocampus. Значительное снижение экспрессии MRNA глюкокортикоидных рецепторов в нейронах hippocampus при введении дексаметазона влечет за собой подъем уровней экспрессии 5-НТ1а и 5-НТ2 рецепторов к серотонину в neocortex и hippocampus (Slotkin T.A., Kreider M.L., Tate C.A., 2006; Erdeljan P., Andrews M.H., MCDONALD J.F., et al., 2005). При этом в гиппокампе существенно снижаются концентрации глиального белка S100-beta (Bruschettini M., van den Hove D.L., Gazzolo D., et al., 2005), через который осуществляется непрямое действие серотонина на пролиферацию и дифференцировку нейронов этих структур. Можно предположить, что обнаруженные нами нарушения развития формаций hippocampus могут быть связаны с дисбалансом глюкокортикоидных гормонов и серотонина, которые оказывают существенное влияние на развитие neocortex и формации hippocampus, что еще раз подтверждают представленные данные.

Исследование характера изменений в substantia nigra после пренатального введения дексаметазона выявило существование в развитии этой структуры различных периодов чувствительности нейронов к дексаметазону. Как оказалось, введение дексаметазона на более ранних и более поздних стадиях пренатального развития (13 и 19 эмбриональные сутки) вызывает глубокие повреждения, включающие изменение соотношения разных типов клеток, уменьшение размеров клеточных тел, появление нейронов, имеющих тяжелые изменения ядра и цитоплазмы. Воздействие дексаметазона в середине пренатального периода (16 эмбриональные сутки) не оказывает значительных изменений в структуре substantia nigra zona compacta.

Рис. 5 Гиппокамп крысы на 60 постнатальные сутки, поле СА1: А - контроль; Б- после пренатального введения дексаметазона в дозе 3 мг/кг на 16 эмбрио