Хроматография. Пути развития хроматографического анализа и возможности классификации хроматографических методов. Выделение и очистка углеводов. Хроматографическое разделение и его основные принципы. Качественная тонкоструйная хроматография сахаров.
Аннотация к работе
Хроматография (от греч. chroma, родительный падеж chromatos - цвет, краска), физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную. Причиной такого разделения являются различия во взаимодействии каждого из компонентов данной смеси веществ, находящихся в первой фазе (растворитель), со второй фазой, называемой сорбентом (твердым или жидким), или с осадителем, помещенным на носителе. СОРБЕНТ - твердое вещество, жидкость или их смеси, способные поглощать или удерживать газы, пары или растворенные вещества и используемые в хроматографии в качестве неподвижной фазы. В настоящее время хроматография применяется со многими методическими изменениями, которые имеют одну общую основу: разделение происходит вследствие частого перехода молекул отдельных компонентов смеси между двумя фазами, из которых одна является неподвижной фазой с развитой поверхностью, а вторая фаза (подвижная) перемещается относительно нее. Дести (1957) предложил в связи с этим классификацию только на основе агрегатного состояния обеих фаз: хроматография газ - жидкость (ГЖХ), хроматография газ - твердое тело (ГТХ), хроматография жидкость - жидкость (ЖЖХ), хроматография жидкость - твердое тело (ЖТХ).Начиная с этого времени ТСХ широко используется для идентификации углеводов, в том числе незамещенных моно-и олигосахаридов и различных производных сахаров и сложных эфиров, циклических ацеталей и других производных. Если на силикагеле не удается достичь хорошего разрешения основных или нейтральных сахаров и их производных, используют окись алюминия - более активный, чем силикагель, сорбент, обладающий основными свойствами. Перед нанесением слоя пластинки тщательно моют со стиральным порошком, споласкивают дистиллированной водой; и протирают насухо тканью, не оставляющей ворсинок. Суспензию 20 г силикагеля G в 50 мл дистиллированной воды тщательно встряхивают в течение 1 мин, выливают в круглодонную колбу емкостью 250 мл и при помощи пульверизатора при медленном токе воздуха наносят слой на пластинки. Пластинки с нанесенным слоем сушат 10 мин на воздухе, затем досушивают и активируют, выдерживая 30 мин при 130 °С.Этот метод чрезвычайно полезен при изучении кинетики реакций, исследовании их механизма и определении выхода продуктов, однако он применим лишь для анализа смесей, компоненты которых можно полностью разделить. Способы количественного определения делят на две большие группы: а) прямое определение (установление количества вещества непосредственно на пластинке); Ввиду того, что сами сахара не окрашены, их обрабатывают реактивом, вызывающим появление окрашенного пятна на фоне слоя сорбента. Чтобы оценить содержание сахаров в образце, можно также сфотографировать хроматограмму (или сделать фотокопию) и, разрезав поученный снимок на полосы, просканировать их на денситометре. Сахара, несущие радиоактивную метку, количественно определяют непосредственно на хроматограмме с помощью счетчика радиоактивности или радиоавтографическим методом путем денситометрического сканирования рентгеновского снимка хроматограммы.Препаративное разделение 0,05-1 г веществ методом ТСХ становится возможным при применении толстого слоя сорбента (0,5-5 мм). Было показано, что прибавление к сорбенту различных сложных эфиров целлюлозы низкой степени замещения, а также добавление метанола к суспензии сорбента перед нанесением его на пластинку позволяют избежать появления трещин. Однако если сорбент содержит флуоресцентный индикатор, добавление метанола приводит к неравномерному окрашиванию фона. В тех случаях, когда в сорбенте присутствуют примеси, мешающие вымыванию веществ, перед изготовлением суспензии необходимо промыть сорбент хлороформом. в) опрыскивание части слоя, перенесенного с хроматограммы на липкую ленту или пластинку, реагентами, вызывающими деструкцию сахаров;Одним из основных факторов, обусловливающих сорбцию сахаров точно так же, как и других полярных неэлектролитов в данном виде хроматографии, является неодинаковое распределение компонентов элюирующей смеси между смолой и внешним раствором. На состав подвижной и неподвижной фаз существенное влияние оказывает также взаимодействие смола - растворитель и смола - растворенное вещество. Коэффициенты распределения веществ возрастают с увеличением концентрации спирта и уменьшаются с повышением температуры. Введение в молекулу неполярных групп, например метильных, приводит к уменьшению коэффициента распределения. Распределительная хроматография на ионообменных смолах была с успехом применена для разделения моно-и олигосахаридов, альдитов и производных сахаров, не содержащих ионогенных группировок, например гликозидов и частично метилированных сахаров.В последнее время хроматографию на бумаге все чаще начинают использовать в качестве самостоятельного количественного метода. При этом весьма широкое распространение получает количественная хроматография углеводов: моно-, ди-и олигосахаридов, а также