Изучение механизмов функционирования и регуляции If/HCN канала и селекция пейсмекероподобных клеток из эмбриональных стволовых клеток. Определение патогенеза нарушений электрофизиологических свойств изоформ HCN1, 2 и 4 при повышении уровне калия.
Аннотация к работе
Характеристика и регуляция кардиального пейсмекерного канала If/HCN, разработка научных подходов к созданию биологических пейсмекеровРабота выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» и Военно-медицинской академии им. Научные консультанты: доктор медицинских наук профессор Цыган Василий Николаевич доктор медицинских наук профессор Белевитин Анатолий Борисович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Васильев Андрей Глебович доктор медицинских наук профессор Войцицкий Анатолий Николаевич доктор медицинских наук профессор Нифонтов Евгений Михайлович Защита состоится «31» марта 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета 215.002.03 при Военно-медицинской академии им С.М. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Военно-медицинской академии им С.М.3. ?-субъединица калиевых каналов MIRP1 модифицирует функции канала HCN: увеличивает плотность тока в HCN2 и HCN4, кинетику активации всех изоформ HCN, экспрессию мембранных белков HCN2 и HCN4 и дифференцированно действует на вероятность нахождения канала в открытом/закрытом состояниях, доступность, вероятность открытия и, в то же время, увеличивает амплитуду открытия канала для всех изоформ. Для определения If/HCN токов в кардиомиоцитах и эмбриональных стволовых клетках использованы 2 варианта метода микроэлектродных экспериментов (МЭ): «вся клетка» (whole cell), «один канал» (single channel). В варианте «один канал» представлены также 2 типа: «прикрепленный к клетке», в котором активность канала записывается непосредственно на мембране и «вне клетки», когда с помощью пипетки отрывают кусочек мембраны клетки. МЭ «один канал», тип «прикрепленный к клетке» HCN1(4), HCN2(7), HCN4(8), всего 19 клеток HCN1(4), HCN2(7), HCN4(8); HCN1*(5), HCN2*(5), HCN4*(4); всего 33 клетки HCN2 (4); HCN2 при Ca2 2ммоль (6); всего 10 клеток 3 сердца, 4 клетки 36 сердец, 4 клетки - - Величина If /HCN тока в экспериментах «вся клетка» была измерена при подаче тестового потенциала в диапазоне от - 30 до - 150 МВ (в некоторых экспериментах - до - 180 МВ) с увеличивающимся шагом 10 МВ между потенциалами в течении 2,45 - 3 с как разница между «мгновенным» током в начале гиперполяризации (рис.Наибольшим сходством с нативным If обладает изоформа HCN2, что позволяет считать ее оптимальным кандидатом для создания биологического пейсмекера путем трансфекции клеток-носителей при поражении синоатриального узла. В исследованиях типа «вся клетка» MIRP1 увеличивает плотность тока в HCN2 и HCN4, кинетику активации всех HCN изоформ, экспрессию мембранных белков HCN2 и HCN4, а при одноканальных измерениях дифференцированно действует на вероятность нахождения каналов в открытом/закрытом состояниях, доступность, вероятность открытия и увеличивает амплитуду открытий канала всех изоформ. Из эмбриональных стволовых клеток получены клетки, экспрессирующие зеленый флюоресцирующий белок EGFP (enhanced green fluorescent protein) под транскрипционным контролем кардиоспецифичного промотора гена ANP (atrial natriuretic peptide) по морфологическим признакам веретенообразной формы, обладающие электрофизиологическими характеристиками пейсмекерных клеток, которые могут быть использованы при создании биологических пейсмекеров. Разработаны научные подходы к созданию биологических пейсмекеров на основе изоформы HCN2, обладающей электрофизиологическими свойствами нативного канала If, а также ANP-EGFP-позитивных пейсмекероподобных клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток, для их использования при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, в частности, синдрома слабости синусового узла. Для создания биологических пейсмекеров при поражении синоатриального узла с помощью морфологических критериев возможно идентифицировать пейсмекероподобные клетки в эмбриональных стволовых клетках среди клеток, экспрессирующих EGFP под транскрипционным контролем кардиоспецифичного промотора.