Вплив кофеїну на системи активного та пасивного транспорту іонів кальцію в мітохондріях міометрія. Флуоресцентний метод визначення концентрації аденозинтрифосфату у водних розчинах. Основні ефектори, що спричиняють дисипацію мембранного потенціалу.
Аннотация к работе
Вважають, що виникнення різноманітних патологій репродуктивної функції (спонтанні аборти, гіпо-і гіпертонус матки тощо) повязане з порушенням гомеостазу іонів Са, яким, як відомо, належить фундаментальна роль у забезпеченні контролю скоротливої активності мяза [Burdyga T., Wray S., 2002; Бабіч Л.Г., 1999]. Ідентифікація цих систем, вивчення їхніх властивостей, особливостей регуляції транспортної активності та фізіологічної ролі у кальцієвому гомеостазі має виключно важливе значення для розуміння іонних, молекулярних та мембранних механізмів електро-та фармакомеханічного спряження в гладеньких мязах [Kosterin S. et al, 1999; Kosterin S., 2003]. Участь МХ у внутрішньоклітинному гомеостазі Са2 обумовлюється їх переважним розміщенням у тих частинах клітини, де виникають локальні високі концентрації Са2 , що необхідні для активації мітохондріального Са2 -уніпортера - біля кальцієвих каналів ендо/саркоплазматичного ретикулуму (ЕР, СР) та плазматичної мембрани (ПМ) [Gunter E. et al, 2004; Rizutto R. et al, 2004]. Не дивлячись на те, що питання про роль МХ у підтримці внутрішньоклітинного гомеостазу іонів Са у гладеньких мязах вже давно привертає увагу дослідників, ряд експериментальних задач потребують подальшого зясування. Приймаючи до уваги провідну роль Са2 у розвитку процесу скорочення, вбачається корисним дослідити вплив даного алкалоїду на мембранозвязані Са2 -транспортуючі системи, що беруть участь у регуляції внутрішньоклітинного гомеостазу іонів Са у гладеньких мязах.У даній роботі, виконаній із використанням Са2 -чутливого флуоресцентного зонду тетрацикліну, були досліджені кінетичні закономірності транспорту іонів Са в ізольованих мітохондріях міометрія невагітних щурів, вивчено вплив кофеїну на цей процес. Наші дані свідчать, що протонофор-та азид-чутливі складові збільшення флуоресцентного сигналу тетрацикліну, які є резистентними до тапсигаргіну, характеризують Mg2 ,АТР-залежну оборотну акумуляцію іонів Са в мітохондріях. Протонофор СССР, азид та Са2 -іонофор А-23187 стимулювали пасивне вивільнення іонів Са із мітохондрій за умов попереднього енергозалежного накопичення цього катіону в них. Кофеїн, внесений у середовище інкубації, дозозалежно гальмує акумуляцію іонів Са (значення константи інгібування І0.5 становить 10,4 ± 1,8 ММ) та Н -АТРАЗНУ активність в мітохондріях, зменшуючи як платовий (у часі) рівень акумуляції катіону, так і величину константи швидкості цього процесу.
Вывод
кофеїн мітохондрія аденозинтрифосфат мембранний
На теперішній час доведена важлива роль мітохондрій у контролі внутрішньоклітинної концентрації іонів Са, у тому числі в гладеньких мязах. У даній роботі, виконаній із використанням Са2 -чутливого флуоресцентного зонду тетрацикліну, були досліджені кінетичні закономірності транспорту іонів Са в ізольованих мітохондріях міометрія невагітних щурів, вивчено вплив кофеїну на цей процес.
Наші дані свідчать, що протонофор- та азид-чутливі складові збільшення флуоресцентного сигналу тетрацикліну, які є резистентними до тапсигаргіну, характеризують Mg2 ,АТР-залежну оборотну акумуляцію іонів Са в мітохондріях. Кінетика акумуляції Са2 задовольняє закономірностям реакції першого порядку (константа швидкості k становить (4,8 ± 0,7) x10-2 с-1).
Протонофор СССР, азид та Са2 -іонофор А-23187 стимулювали пасивне вивільнення іонів Са із мітохондрій за умов попереднього енергозалежного накопичення цього катіону в них. Протонофор здатний більш ефективно, ніж азид, індукувати вивільнення Са2 із цих субклітинних структур: значення k становлять (8,6 ± 0,8) x10-2 та (3,8 ± 0,2) x10-2 с-1 відповідно.
Величина константи швидкості k акумуляції іонів Са у мітохондріях куполоподібно залежить від концентрації іонів Mg (оптимальне значення - 3 - 5 ММ) та збільшується із зростанням концентрації АТР (до 3 ММ), але практично не залежить від концентрації сукцинату (до 3 ММ) у середовищі інкубації.
Кофеїн, внесений у середовище інкубації, дозозалежно гальмує акумуляцію іонів Са (значення константи інгібування І0.5 становить 10,4 ± 1,8 ММ) та Н -АТРАЗНУ активність в мітохондріях, зменшуючи як платовий (у часі) рівень акумуляції катіону, так і величину константи швидкості цього процесу. У випадку попередньої інкубації мітохондрій з кофеїном при відсутності реагентів, що забезпечують транспортний процес (Са2 , Mg2 , АТР) також спостерігається пригнічення акумуляції іонів Са. Кофеїн стимулює пасивне вивільнення іонів Са з мітохондрій, які попередньо були навантажені цим катіоном у енергозалежному процесі.
Циклоспорин А (5 МКМ) стимулює на (30 %) акумуляцію іонів Са в мітохондріях, але не впливає на їх пасивний вихід із цих субклітинних структур. На фоні пригнічуючої дії кофеїну (20 ММ) на акумуляцію іонів Са стимулюючий ефект циклоспорину А (5 МКМ) не спостерігається.
Із використанням флуоресцентного зонду 3-гідрокси 4-диметиламінофлавону розроблено метод визначення концентрації АТР у водних розчинах.
Список литературы
Вадзюк О.Б., Борисова Л.А., Тітус О.В., Костерін С.О. Чутлива до СССР зміна флуоресценції тетрацикліну за умов моделювання Mg2 , АТР-залежного транспорту іонів Са в мітохондріях гладенького мяза.// УБЖ. - 2003. - т.75, N4.- С. 64-74.
Вадзюк О.Б., Костерін С.О. Вплив кофеїну на азидчутливе Mg2 , АТР-залежне збільшення флуоресцентної відповіді тетрацикліну при моделюванні акумуляції іонів Са в мітохондріях.// УБЖ. - 2003. - т. 75, N6.- С. 47 - 55.
Вадзюк О.Б. Вплив кофеїну та ЦСА на трансмембранний обмін іонів Са в мітохондріях гладенького мяза.// УБЖ. - 2005. - т.77, N2.- С. 77-82.
Pivovarenko V.P., Vadzyuk O.B., Kosterin S.O. Fluorometric detection of adenosine triphosphate with 3-hydroxy-4’(dimethylamino)flavone in aqueos solutions.// Journal of Fluorescence.- V.16, N 1. - Р.9 - 15.
Патент на винахід N 75448 UA, 7МПК, GO 21/64, GO1N 33/52, C07D 311/30, C07D221/06. Спосіб флуориметричного визначення концентрації аденозин-5’-трифосфату (АТР) у розчині/ Пивоваренко В.Г., Вадзюк О.Б., Костерін С.О. Заявл. 15.03.2004, Опубл. 17.04.2006, Бюл. N 4.
Vadzyuk O.B. CCCP- and azide-sensitive Ca2 accumulation in myocytes and the effect of caffeine on this process//. - International Congress “Physiology and Biophysics of the Smiito Muscle”. - 2003.-Р.377.
Вадзюк О.Б. Влияние кофеина на Mg2 ,АТР-зависимое накопление ионов Са митохондриями миоцитов матки// 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. - Сборник тезисов.-2003.-Р.313.
Вадзюк О.Б. Вплив кофеїну на СССР- та NAN3-чутливу Mg2 ,АТР-залежну систему акумуляції іонів Са в клітинах міометрію.// Конференція-конкурс робіт молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”. - Київ. - 2003. - Р.8