Ознакомление с источниками выделения для мезофильных молочнокислых бактерий. Исследование и характеристика особенностей выделенных высокоактивных штаммов микроорганизмов, которые позволят получить закваску с необходимыми пробиотическими свойствами.
Аннотация к работе
Выделение чистых культур молочнокислых бактерий включает ряд этапов: выбор источников, отбор образцов, посев на жидкую питательную среду для обогащения молочнокислой микрофлорой, посев на плотную среду для выделения чистой культуры, пересев чистой культуры (колоний) в стерильное молоко, исследование биологических свойств выделенных штаммов в целях их идентификации и определения производственной ценности. Это жидкие и агаризованные среды, в их состав входят ингредиенты, богатые аминокислотами и витаминами, томатный сок, дрожжевой экстракт и автолизат, белковые гидролизаты [2]. Источниками выделения для мезофильных молочнокислых бактерий являются сырое молоко, производимые в южном регионе Республики Казахстан национальные кисломолочные продукты, в основном слабоскисшийся айран, курт, кумыс, кымыран, каймак, сузбе, а также приготовленные по разным рецептурам коже. Если культуру выделяют из кисломолочных продуктов, то одну каплю продукта вносят бактериологической петлей в стерильное молоко. При выделении мезофильных молочнокислых стрептококков из растительного сырья 1 г пробы растирают в стерильной ступке и готовят разведение 1:10 на физиологическом растворе.В результате проделанной работы из различных национальных молочных продуктов были выделены 207 колоний, из которых в дальнейшем, использовались только 25 колоний, как наиболее часто встречающиеся, следовательно, более адаптированых к местным условиям. Выраженная способность к продуцированию молочной кислоты является одним из наиболее известных биологических свойств молочнокислых бактерий, которая рассматривается в качестве одного из основного параметра, характеризующего их биохимическую и антагонистическую активность [1]. Штаммы, титруемая кислотность которых колеблется в пределах 20-80°Т, считаются неактивными, а те у которых этот параметр свыше 120°Т высокоактивными [7]. Несмотря на то, что именно воздействие молочной кислоты рассматривают как выраженное бактерицидное свойство, однако, по мнению многих авторов полной аналогии между интенсивностью кислотообразования и антагонистической активностью молочнокислых бактерий не происходит [1; 5]. Желудок и верхняя часть тонкой кишки почти свободны от бактерий, так как бактерии, поступившие извне с пищей, почти полностью уничтожаются соляной кислотой, содержащейся в желудочном соке.
Введение
Выделение чистых культур молочнокислых бактерий включает ряд этапов: выбор источников, отбор образцов, посев на жидкую питательную среду для обогащения молочнокислой микрофлорой, посев на плотную среду для выделения чистой культуры, пересев чистой культуры (колоний) в стерильное молоко, исследование биологических свойств выделенных штаммов в целях их идентификации и определения производственной ценности. Для выделения молочнокислых бактерий из различных источников рекомендован ряд сред. Это жидкие и агаризованные среды, в их состав входят ингредиенты, богатые аминокислотами и витаминами, томатный сок, дрожжевой экстракт и автолизат, белковые гидролизаты [2].
Материалы и методы
Источниками выделения для мезофильных молочнокислых бактерий являются сырое молоко, производимые в южном регионе Республики Казахстан национальные кисломолочные продукты, в основном слабоскисшийся айран, курт, кумыс, кымыран, каймак, сузбе, а также приготовленные по разным рецептурам коже. Если культуру выделяют из кисломолочных продуктов, то одну каплю продукта вносят бактериологической петлей в стерильное молоко. Посевы термостатируют при 25-30°С до свертывания молока. При выделении мезофильных молочнокислых стрептококков из растительного сырья 1 г пробы растирают в стерильной ступке и готовят разведение 1:10 на физиологическом растворе.
Процесс выделения чистых культур термофильных бактерий аналогичен процессу выделения мезофильных молочнокислых стрептококков. В качестве накопительных культур использовали айран, катык, курт, сузбе и другие национальные продукты. При этом термофильные молочнокислые стрептококки и палочки культивируют при 40-43 °С, за исключением ацидофильной палочки, которую выращивают при 37 °С. После проверки сгустка на типичность органолептических свойств и микрофлоры полученную обогащенную культуру, выращенную на стерильном молоке, высевают на плотную питательную среду (агар с гидролизованным молоком). Посевы термостатируют в течение 48 ч.
Выделенные высокоактивные штаммы микроорганизмов позволят получить закваску с необходимыми пробиотическими свойствами. Предпочтение отдавали тем культурам, которые обладали достаточно высокой активностью сквашивания молока, значительной антагонистической активностью, устойчивостью к антибиотикам. Штаммы молочнокислых бактерий, выделенные из различных источников, микроскопировали и изучали их активность при свертывании молока и органолептические показатели. Для выделения чистой культуры в качестве твердой питательной среды использовали гидролизованное молоко с агаром и среду MRS.
Вывод
В результате проделанной работы из различных национальных молочных продуктов были выделены 207 колоний, из которых в дальнейшем, использовались только 25 колоний, как наиболее часто встречающиеся, следовательно, более адаптированых к местным условиям.
По-видимому, использование молочной продукции южного региона оказало существенное влияние на оптимальный и предельный температурный рост. Среди исследуемых культур преобладают термолабильные и термофильные организмы (SSH-23, АТ-3, IT-2, ТК-23, ZT-27. KL-21, KUA-16, KUS-12).
Выраженная способность к продуцированию молочной кислоты является одним из наиболее известных биологических свойств молочнокислых бактерий, которая рассматривается в качестве одного из основного параметра, характеризующего их биохимическую и антагонистическую активность [1]. Это один из важных факторов антагонизма в отношении других видов микробов. Активность кислотообразования является нормируемым показателем специфической активности лактосодержащих пробиотиков и соответственно критерием отбора штаммов лактобактерий при разработке новых бактерийных препаратов [4].
Селекцию новых штаммов, в дальнейшем планируемые использовать как пробиотики, проводили по таким параметрам как продолжительность свертывания и кислотообразующая активность. Штаммы, титруемая кислотность которых колеблется в пределах 20-80°Т, считаются неактивными, а те у которых этот параметр свыше 120°Т высокоактивными [7].
Полученные в результате экспериментальных работ данные свидетельствуют о хорошей кислотообразующей способности у большинства исследуемых штаммов. молочнокислый пробиотический мезофильный
Несмотря на то, что именно воздействие молочной кислоты рассматривают как выраженное бактерицидное свойство, однако, по мнению многих авторов полной аналогии между интенсивностью кислотообразования и антагонистической активностью молочнокислых бактерий не происходит [1; 5].
В таблице 1 представлены данные об основных культуральных и физиологических свойствах выделенных штаммов.
Таблица 1. Основные культуральные и физиологические свойства выделенных штаммов.
№ п/п Условное обозначение штаммов Продолжительность свертывания при внесении 3 % закваски, час Кислотообразование в молоке, ОТ Температура роста, ОС Рост в молоке при температуре, ОС Рост в молоке после нагревания в течение 30 мин, ОС
После 8 часов Предельная Оптимальная Предел 40 45 55 60
1 KSH-12 4-5 75 120 28-32 10-42 - - -
2 SSH-23 4-6 85 115 40-45 15-55 -
3 Sha-2 4-5 80 110 28-32 10-39 - - - -
4 Sl-12 6-8 80 110 28-30 10-32 - - - -
5 Sh-4 4-6 75 115 28-30 12-32 - - - -
6 IT-2 3,5-5 90 120 40-45 15-55 -
7 Тр-2 4-5 100 300 37-38 20-55 -
8 АТ-3 3,5-5 110 170 40-45 15-55 -
9 ТК-23 3,5-5 120 190 40-42 15-60
10 ZT-27 4-5 120 180 40-45 20-55 -
11 СС-2 4-5 90 120 28-32 10-39 - - -
12 КК-31 3,5-5 80 120 40-45 15-55 -
13 SSA-1 4-5 80 120 28-32 10-39 - - - -
14 SPA-1 4-5 75 110 28-32 10-39 - - - -
15 CPM-2 4-5 180 320 40-45 20-55
16 CPZ-1 4,5-5,5 75 110 22-35 10-40 - -
17 AL-32 4-5 120 180 37-38 20-55 -
18 KL-21 4-5 120 200 40-45 15-55 -
19 КА-5 4-5 75 110 28-34 10-45 - - -
20 KUS-12 3,5-5 90 150 40-45 15-60
21 ZPA-22 4-5 100 140 28-32 10-45 - - -
22 KUA-16 4-5 145 300 40-45 20-55 -
23 KL-23 4-5 120 180 37-38 20-55 - - -
24 К-1 4-5 80 120 28-32 10-39 - - - -
25 К-3 5-5,5 75 100 28-34 10-39 -
Устойчивость выделенных штаммов к желчи является косвенным показателем жизнеспособности клеток, которая возможно обеспечит их поступление в кишечную зону и реализацию пробиотических их свойств. Это связано с тем, что пробиотик, прежде чем достигнуть толстого кишечника, должен выжить при проходе через желудок. Неблагоприятное действие желудочного сока является основным барьером, который необходимо преодолеть выделенным и вносимым бактериям. Среди молочнокислых бактерий наиболее кислотоустойчивыми являются лактобактерии, которые обладают достаточной степенью резистентности к кислому содержимому желудка [3, 6]. Наибольшее содержание микроорганизмов наблюдается в толстой кишке. Здесь их концентрация достигает 1010-1011 и более на 1 г содержимого.
Нами были проведены эксперименты по определению устойчивости выделенных штаммов к соляной кислоте. В жидкую среду MRS, засеянную тестируемыми бактериями, вносили соляную кислоту, устанавливая значения РН от 4,5 до 6,5. Установлено, что значительное количество выделенных культур обладают достаточной устойчивостью к кислой среде. Лишь отдельные культуры, такие как СС-2, CPZ-1 показали низкий рост при внесении соляной кислоты.
Устойчивость к низким значениям РН - одна из основных характеристик для пробиотических бактерий [10]. Бактерии вместе с пищей попадают в неблагоприятные для них условия желудка. Хотя подавляющие условия желудка вызваны PH близкой к 1,5, в большинстве случаев, в лабораторных условиях in vitro выбирают обычно PH 3.
Рисунок 1 показывает способность молочнокислых бактерий выживать в кислой среде (PH 3).
Рис. 1. Способность молочнокислых бактерий выживать в кислой среде (PH 3).
Следующие штаммы SSH-23, Sha-2, IT-2, CC-2, KK-31, SSA-1, KUA-16 и K-3 показывают значительную устойчивость к низким РН. Данные штаммы не только устойчивы к кислой среде, но и способны к дальнейшему росту и размножению. Некоторые штаммы обладают более низкой способностью к развитию в кислой среде, однако необходимо отметить, что выращенные культуры, в целом, показывают хорошую устойчивость к низким РН.
Желудок и верхняя часть тонкой кишки почти свободны от бактерий, так как бактерии, поступившие извне с пищей, почти полностью уничтожаются соляной кислотой, содержащейся в желудочном соке. Одним из основных требований к современному пробиотическому препарату, является его устойчивость к действию желчи и желудочного сока.
Желчь выделяется в тонкой кишке и присутствие желчи создает неблагоприятные условия для большинства бактерий. Желчные соли уменьшают выживание бактерий, поскольку взаимодействуют с клеточной мембраной бактерий, в которой основные компоненты - липиды и жирные кислоты. Блокирующее воздействие отрицательно влияет на проницаемость клетки [8].
Суточная культура была внесена нами в среду бульона MRS, содержащую концентрат желчи 0,3% и 0,5%. Бактериальный рост анализировался путем подсчета жизнеспособных колоний после 0, 2 и 4 часа культивирования и при дальнейшем инокулировании в агаризованную среду при 37OC в течении 48 часов. 0,1 мл раствора, который содержал определенный, ранее выделенный штамм был добавлен в 10 мл бульона MRS, затем был инокулирован 24 часа при 37OC.
Рисунок 2 показывает выживание молочнокислых бактерий в среде содержащей 0,3 % и 0,5% желчных солей.
Наиболее устойчивыми к кислой среде оказались штаммы KSH-12, ZT-27, KK-31, Spa-1, SSA-1, KUA-16, K-3.
Средняя концентрация желчи в кишечнике - 0,3% и время нахождения пищи в тонкой кишке приблизительно 4 часа [9]. Проведенные опыты показывают значительную устойчивость выделенных культур к действию желчи.
В ходе изучения морфологических признаков мы убедились, что клетки всех исследуемых культур были неподвижны, не содержали спор, окрашивались положительно по Граму и были каталазонегативны. По этим признакам они являются типичными представителями семейства молочнокислых бактерий.
Приведенные морфологические и культуральные свойства молочнокислых бактерий использовали для их идентификации. Способность молочнокислых бактерий к сбраживанию углеводов сильно варьирует при изменении условий культивирования, но данный признак можно рассматривать как вспомогательный при их идентификации, поэтому у выделенных микроорганизмов была изучена и сбраживаемая углеводная способность.
В соответствии с определителем Bergey выделенные молочнокислые бактерии были отнесены к роду Streptococcus и Lactobacterium. Изученные культуральные и морфологические признаки клеток дали возможность определить видовую принадлежность исследуемых штаммов: из 25 штаммов 5 штаммов являются представителями Lac lactis; к S. thermophilus относятся 6 штаммов; к L. acidophilus относятся 5 представителей; к представителям Lbm. bulgaricus мы отнесли 5 выделенных штаммов. Две культуры были отнесены к Lbm. plantarum и два выделенных штамма к Lbm. Casei.
Список литературы
1. Глушанова Н.А., Блинова А.И., Бахаева В.В. Об антагонизме пробиотических лактобацилл // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2004. - № 6. - С. 37-39.
2. Гудкова М.Я. Технология бифидосодержащих молочных продуктов: Автореф. дис. канд. техн. наук. - Л., 2006, 16 с.
3. Ленцнер А.А., Микельсаар М.Э., Воронина М.Н. О количественном составе микрофлоры кала здоровых взрослых при обычном питании // 16 научная сессия ин-та питания АМН СССР: Тез. докл. - М., 1966. - С. 153-154.
4. Лиходед В.Г., Бондаренко В.М. Антиэндотоксиновый иммунитет в регуляции численности эшерихиозной микрофлоры кишечника. Медицина, 2007. - 216 с.
5. Тюрин М.В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл: дис. … канд. мед. наук. - М., 1990. - 146 с.
6. Чернякова В.И., Смирнова Т.В. Влияние желчи на интестинальные аэробные бактерии // Врач. дело. - 1978. - № 10. - С. 87-91.
7. Эйсфельд Д.А. Биологическая характеристика производственных штаммов лактобактерий: дисс…. канд. биол. наук. - 2002. - 129 с.
8. Gilliland, S.E, Staley, T.E., and Bush, L.J. 1984. Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as dietary adjunct. J. Dairy Sci. 67: 3045-3051.
9. Prasad, R.; Sankhyan, S. K.; Karim, S. A., 1998. Growth performance of broiler rabbits fed on diets containing various types of protein supplements. Indian J. Anim. Prod. Manage., 14 (4): 227-230.
10. Saarela M., Mogensen G., Fonden R., Matto J. and Matilla S. T. 2000. Probiotic bacteria: Safety, functional and technological properties. Journal of Biotechnology 84: 197-215.