История открытия политенных хромосом. Хромомерный рисунок в политенных хромосомах. Метод приготовления давленных микропрепаратов. Построение цитологических карт. Органы, содержащие клетки с политенными хромосомами. Пуфы на политенных хромосомах.
Аннотация к работе
Актуальность выпускной квалификационной работы связана с широким распространением изучения мутаций в современной биологии и медицине. Кольцова) на культуре клеток дрозофилы было показано явление активации экспрессии гена lawc, которое заключалось в увеличении концентрации МРНК этого гена в ответ на его подавление в условиях РНК-интерференции. Политенные хромосомы были выбраны как наиболее удобная модель для наших целей, поскольку активность гена на транскрипционном уровне можно визуализировать через формирование пуфа в районе локализации гена.Данное исследование проводилось на классическом объекте генетики - мухе дрозофиле (Drosophila melanogaster). Муха была выбрана изза следующих особенностей: • высокая плодовитость (от одной пары особей можно получить от 100 до 175 потомков); Самка откладывает яйца в субстрат. Яйца удерживаются в субстрате благодаря небольшим отросткам. Из яйца появляется личинка, которая активно питается, проходит три стадии развития и окукливается.В лаборатории мух содержат в плоскодонных пробирках с питательной средой, которые закрывают пробками из ваты. Главными составными частями среды, на которой разводят дрозофилу в лабораториях, являются сахар и дрожжи. Дрожжи предохраняют среду от поражения плесенью и являются главным элементом пищи дрозофилы. Содержат мух при комнатной температуре, либо в термостате. В ходе опыта мухи пересеивались в новые пробирки каждый день, чтобы избежать перенаселения личинок в пробирке (в пробирке должно быть не более 20 личинок).В своей работе мы исследовали индуцибельную экспрессию гена D. melanogaster - lawc - на политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы. Этот ген локализуется в цитологическом районе 7Е на карте политенных хромосом (рис. Нужный участок политенной хромосомы находился с помощью цитологической карты. В ходе опыта был сделан контрольный микропрепарат из слюнных желез мух линии Ri13 (содержались при комнатной температуре, тепловому шоку не подвергались). Предварительные данные (Черезов, неопубл.) показывали, что на стадии личинки исследуемый ген неактивен, чему соответствовала полоса в районе 7Е на политенных хромосомах контрольной линии (Рис.В ходе работы было установлено, что линию Ri13 можно использовать в экспериментах по визуализации экспрессии гена lawc на политенных хромосомах. Таким образом, мы In vivo продемонстрировали явление РНК-активации гена lawc, которое заключается в усилении экспрессии гена в ответ на двухцепочечные молекулы РНК, комплементарные его транскриптам, впервые показанное для дрозофилы в нашей лаборатории (Черезов, неопубл).1) Результатом инактивации гена lawc в условиях РНК-интерференции в слюнных железах, используя линию-драйвер Sgs>Gal4, стало формирование пуфа в районе локализации этого гена, что говорит об активации его экспрессии на уровне транскрипции МРНК.
Введение
Актуальность выпускной квалификационной работы связана с широким распространением изучения мутаций в современной биологии и медицине. Изучаемые процессы являются наглядной моделью для выяснения механизмов индукции экспрессии генов.
Ранее в лаборатории Регуляции морфогенеза (ИБР РАН им. Н.К. Кольцова) на культуре клеток дрозофилы было показано явление активации экспрессии гена lawc, которое заключалось в увеличении концентрации МРНК этого гена в ответ на его подавление в условиях РНК-интерференции. Однако вопрос, на каком уровне происходит активация - на транскрипционном, или пост-транскрипционном - оставался неисследованным. Политенные хромосомы были выбраны как наиболее удобная модель для наших целей, поскольку активность гена на транскрипционном уровне можно визуализировать через формирование пуфа в районе локализации гена. При этом Drosophila melanogaster является наиболее удобным лабораторным объектом.
Целью данной работы является изучение активности гена lawc на политенных хромосомах Drosophila melanogaster.
В работе были поставлены следующие задачи: 1) Отработка метода приготовления давленных микропрепаратов
2) Активировать инактивирующую конструкцию, направленную на подавление экспрессии гена lawc по пути РНК-интерференции, в слюнных железах личинок дрозофилы, используя линию драйвер Sgs>Gal4, и проанализировать морфологию района локализации гена lawc.
3) Индуцировать кратковременную активацию инактивирующей конструкции в условиях теплового шока, используя линию драйвер hsp70>Gal4, и проанализировать морфологию района локализации гена lawc на политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы.
1.
Вывод
В своей работе мы исследовали индуцибельную экспрессию гена D. melanogaster - lawc - на политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы. Этот ген локализуется в цитологическом районе 7Е на карте политенных хромосом (рис. 8).
Нужный участок политенной хромосомы находился с помощью цитологической карты.
В ходе опыта был сделан контрольный микропрепарат из слюнных желез мух линии Ri13 (содержались при комнатной температуре, тепловому шоку не подвергались). Предварительные данные (Черезов, неопубл.) показывали, что на стадии личинки исследуемый ген неактивен, чему соответствовала полоса в районе 7Е на политенных хромосомах контрольной линии (Рис. 8).
Рис. 8. Политенная Х-хромосома. Контроль. Пуфа в 7Е-районе нет. Полоса в районе 7Е говорит о морфологически неактивном хроматине этого района.
Активацию гена lawc проводили в потомках от скрещивания Sgs x >Ri13 с постоянными условиями в термостате. При этом использовалась линия- драйвер Sgs-Gal4, которая активировала конструкцию UAS-Ri13 (линия Ri13) в гибридных потомках от этого скрещивания. Далее, из слюнных желез гибридных личинок Sgs/Ri13 были получены препараты политенных хромосом и проанализирован район локализации гена lawc - 7E.
Были обнаружены слабые пуфы, и исчезновение полосы гетерохроматина в 7Е районе, что говорит об активности исследуемого гена (рис. 9).
Рис. 9. Политенные хромосомы слюнных желез личинок линии Ri13(сверху контроль), и Sgs/Ri13 (снизу - результат эксперимента). Видно исчезновение полосы гетерохроматина в районе 7Е на нижней фотографии (стрелка).
В результате опыта hsp-Gal4 x >Ri13 с воздействием теплового шока в течение 30 минут также были получены пуфы на исследуемых участках (рис. 10).
Рис.10 Политенные хромосомы слюнных желез личинок линии Ri13 (сверху контроль), и hsp-Gal4/Ri13 (снизу - результат эксперимента). Отчетливо видно вздутие в 7Е районе (районе локализации исследуемого гена).В ходе работы было установлено, что линию Ri13 можно использовать в экспериментах по визуализации экспрессии гена lawc на политенных хромосомах. Была показана активность гена lawc на уровне транскрипции. Таким образом, мы In vivo продемонстрировали явление РНК-активации гена lawc, которое заключается в усилении экспрессии гена в ответ на двухцепочечные молекулы РНК, комплементарные его транскриптам, впервые показанное для дрозофилы в нашей лаборатории (Черезов, неопубл). Конструкция UAS-Ri13 мух линии Ri13 способна синтезировать эти двухцепочечные комплементарные lawc, РНК после ее активации драйвером. Исходно, эта конструкция была синтезирована с целью инактивировать экспрессию lawc по пути РНК-инреференции (нокдаун гена), однако, вместо инактивации, ген lawc активировал свою работу, что было показано на культуре клеток дрозофилы. В своей работе на политенных хромосомах мы подтвердили предварительный результат и показали, что активация идет на уровне транскрипции.
В будущем мы планируем дальнейшие эксперименты по гибридизации in situ хромосом этой линии с меченым зондом из района локализации гена, для более надежной демонстрации результата нашего эксперимента.1) Результатом инактивации гена lawc в условиях РНК-интерференции в слюнных железах, используя линию-драйвер Sgs>Gal4, стало формирование пуфа в районе локализации этого гена, что говорит об активации его экспрессии на уровне транскрипции МРНК.
2) Результатом инактивации гена lawc в условиях РНК-интерференции в слюнных железах, используя линию-драйвер Hsp70>Gal4, стало формирование пуфа в районе локализации этого гена, что подтверждает первый вывод.
Список литературы
1. Воронцова Ю.Е., Черезов Р.О, Симонова О.Б. Влияние мутаций гена lawc/Trf2 на формирование хромоцентра и расхождение хромосом у Drosophila melanogaster. // Генетика. 2013.
2. Жимулев, И.Ф. Общая и молекулярная генетика [Текст]: учеб. пособие для вузов / И.Ф. Жимулев; под ред. Е.С. Беляева, А.П. Акифьева - 4-е изд., стер. - Новосибирск: Сиб. Унив. Изд-во, 2007.
3. Копытова Д.В., Краснов А.Н., Симонова О.Б. и др. Изучение гена lawc- trf2 Drosophila melanogaster и его белкового продукта //ДАН. 2005. Т.405. №1. С.125-127.
4. Медведев Н.Н. Практическая генетика. Издание второе, исправленное и дополненное, 1968 г.
5. Модестова Е.А., Воронцова Ю.Е.,. Корочкин Л.И. и др. Получение летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у D. melanogaster II ДАН. 2005. Т. 403, №4. С. 564-565.
6. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. М:. Наука, 1986, 431 с.
7. Симонова О.Б., Кузин Б.А., Георгиев П.Г. и др. Новая регуляторная мутация Drosophila melanogaster II Генетика. 1992. № 2. Т.28. С. 164- 167.
8. Хлебодарова Т.М. Как клетки защищаются от стресса? // Генетика. 2001 (в печати)
9. Richards G. The ecdysone regulatory cascades in Drosophila // Advances in Developmental Biology, 1997. Vol. 5. P. 81-135
10. Zhimulev I.F. Genetic organization of polytene chromosomes // Advances in Genetics. 1999. Vol. 39. P. 1-599