Структура и поверхностные свойства, функции и самосборка, пенообразующие и пеностабилизирующие свойства гидрофобинов. Глубинное культивирование гриба и высших базидиомицетов. Определение влажности биомассы и количества белка в экстрактах, электрофорез.
Аннотация к работе
1 Аналитический обзор 1.1 Гидрофобины 1.1.1 Общая характеристика гидрофобинов 1.1.2 Структура и поверхностные свойства гидрофобинов 1.1.2.1 Гидрофобины I класса 1.1.2.2 Гидрофобины II класса 1.1.3 Функции гидрофобинов 1.1.4 Самосборка гидрофобинов 1.1.5 Пенообразующие и пеностабилизирующие свойства гидрофобинов 1.2 Pleurotus ostreatus 1.3 Coprinus lagopides 2 Цели и задачи работы 3 Экспериментальная часть 3.1 Объект исследования 3.2 Общий ход работы 3.3 Материалы и методы исследования 3.3.1 Глубинное культивирование гриба 3.3.2 Отделение биомассы продуцента 3.3.3 Определение влажности биомассы 3.3.4 Выделение гидрофобинов 3.3.4.1 Выделение гидрофобинов из культуры гриба 3.3.4.1.1 Экстракция гидрофобинов из биомассы 3.3.4.1.2 Экстракция гидрофобинов из плодовых тел 3.3.4.1.3 Выделение гидрофобинов из нативного раствора 3.3.4.2 Выделение гидрофобинов из культуры гриба 3.3.4.2.1 Экстракция гидрофобинов из биомассы с промежуточной обработкой спиртом 3.3.4.2.2 Экстракция гидрофобинов из биомассы без промежуточной обработки спиртом 3.3.5 Определение количества белка 3.3.6 Разделение экстрактов методом ВЭЖХ 3.3.6.1 Молекулярная адсорбционная хроматография 3.3.7 Определение молекулярной массы (электрофорез) 3.3.7.1 Механизм разделения 3.3.7.2 SDS-PAGE по Лэммли 3.3.7.3 Визуализация продуктов разделения 3.3.7.4 Буферные системы 3.3.8 Оценка влияния полученного продукта на стабильность пены 3.3.9 Определение доверительного интервала 3.4 Результаты и обсуждения 3.4.1 Глубинное культивирование высших базидиомицетов 3.4.2 Динамика роста грибов в глубинной культуре 3.4.3 Определение влажности биомассы 3.4.4 Определение количества белка в экстрактах 3.4.5 Разделение с помощью ВЭЖХ 3.4.6 Электрофорез 3.4.7 Оценка пенообразующей и пеностабилизирующей способностей полученных экстрактов 4 Заключение и выводы Список использованных источников Введение Грибы чрезвычайно богаты различными биологически активными и ценными пищевыми веществами. Целью наших исследований было исследование высших грибов Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides в качестве возможных продуцентов гидрофобинов. Продукт одного из них был обнаружен в клеточных стенках воздушных гиф (SC3), в то время как продукт второго (SC4) - в клеточных стенках гиф, формирующих плодовое тело [2]. В дальнейшем было обнаружено, что гидрофобин SC3, выделенный из S. commune, обладал способностью к формированию гидрофобного слоя палочек или гидрофобиновой мантии in vitro на границе вода-воздух. Только несколько гидрофобинов были выделены и изучены на уровне белка. 1.1.2 Структура и поверхностные свойства гидрофобинов В семейство гидрофобинов входят небольшие секретируемые белки (100±25 аминокислотных остатков), содержащие типичную N-концевую последовательность сигнала секреции. Рисунок 1 - Двухдоменная структура гидрофобинов Первому остатку цистеина предшествует сигнальная последовательность и слабоконсервативные N-концевые сегменты - наиболее вариабельные по аминокислотному составу и длине участки белковой молекулы, которые, кажется, не имеют решающего значения для структурной целостности белков или их поверхностной активности. Рисунок 2 - Сравнение аминокислотной последовательности I и II классов гидрофобинов Гидрофобины класса I собираются в агрегаты, которые стабильны к действию детергентов (даже под действием 2% SDS при 100 ° С) и этанола и могут быть диссоциациированы только высокой концентрацией кислот (например, муравьиная кислота или чистая трифторуксусная кислота), а комплексы гидрофобинов класса II, которые менее стабильны, могут диссоциировать до мономеров под действием 60% этанола или 2% SDS. Рисунок 4 - электронная микрофотография гидрофобиновой пленки Мантия у представителей I и II классов гидрофобинов, по-видимому, неодинакова, и у представителей класса II она гораздо менее стабильна. 1.1.2.1 Гидрофобины I класса Недавно с помощью ЯМР была открыта структура белка EAS из культуры Neurospora crassa, которая аналогична (26,27) структуре гидрофобиновых белков из класса II, HFBI и HFBII. N-и C-концы окрашены в синий и красный, соответственно. с - Две конформации наблюдались в рентгеновской кристаллической структуре HFBI.