Выделение фракций пептидов из проб сывороток крови больных алкоголизмом и больных, подвергшихся терапевтическому лечению. Исследование влияние фракций пептидов на активность карбоксипептидазы Н и фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы.
Аннотация к работе
В эксперименте из проб сывороток крови больных алкоголизмом и больных, подвергшихся терапевтическому лечению, двумя разными методиками были выделены по две фракции пептидов - термостабильные молекулы средней массы (t - МСМ) и осажденные трихлоруксусной кислотой (ТХУ - МСМ), способные проявлять различную биологическую активность. Выявлена зависимость изменения активности данных ферментов при воздействии выделенных из сыворотки крови больных фракций от стадии заболевания и от эффективности терапии. Так как отдельные фракции МСМ обладают нейро-и психотропным свойствами, представляет интерес изучение влияния МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом на активность основного фермента синтеза нейропептидов - карбоксипептидазы Н, а так же на активность такого фермента обмена биологически активных пептидов, как ФМСФ-КП. Исследована кровь 65 - ти больных алкоголизмом в возрасте от 25 до 55 лет, госпитализированных в отделение неотложной наркологической помощи (ОННП) Областной наркологической больницы г. Исследуемых распределяли по группам в соответствии с различными проявлениями заболевания: группа 1 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами проявления алкогольного делирия (АД) группа 2 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами проявления алкогольно-абстинентного синдрома (ААС) группа 3 - больные хроническим алкоголизмом с выраженными соматическими проявлениями (обострение хронических заболеваний, гепатоз, гепатит) группа 4 - больные, прошедшие курс комплексной терапии (инфузионная, антиседативные препараты, витамины, ноотропы, гепатопротекторы) контроль - группа клинически здоровых людей.Во фракциях, полученных кипячением сыворотки крови (t - МСМ) больных алкоголизмом по сравнению с контрольной группой здоровых людей обнаружено повышение ИИ у больных алкоголизмом. Контроль - группа клинически здоровых людей; группа 1 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольного делирия (АД); группа 2 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольно-абстинентного синдрома (ААС). сыворотка кровь фракция пептид Индекс интоксикации больных алкоголизмом, оцененный по определению поглощения фракции ТХУ - МСМ после диализа оказался почти вдвое ниже, чем у контрольной группы здоровых людей (рис.1 б). Так как многие проявления алкоголизма (возбуждение, эйфория, депрессии и т.п.) напрямую связаны с нарушением баланса нейропептидов, представляет интерес изучение влияния фракций МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом на активность ФМСФ - КП. Так, при добавлении термостабильной фракции сыворотки крови (t - МСМ) больных алкоголизмом в острой стадии алкогольного абстинентного синдрома (ААС) (группа 2) мы наблюдали лишь незначительное снижение активности ФМСФ - КП (остаточная активность - 85 %).Обнаружено, что пептидные фракции средних молекул (МСМ) сыворотки крови, полученные различными способами (осаждение белков ТХУ и кипячением) по - разному действуют на активность основных карбоксипептидаз - карбоксипептидазы Н и ФМСФ - ингибируемой карбоксипептидазы.
Вывод
Во фракциях, полученных кипячением сыворотки крови (t - МСМ) больных алкоголизмом по сравнению с контрольной группой здоровых людей обнаружено повышение ИИ у больных алкоголизмом. Наиболее выражено увеличение индекса интоксикации у больных с тяжелыми формами алкоголизма (депрессии, психические расстройства и т.п.) (рис.1).
а. б.
Рис. 1. Значения индекса интоксикации в разных группах. Контроль - группа клинически здоровых людей; группа 1 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольного делирия (АД); группа 2 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольно-абстинентного синдрома (ААС). сыворотка кровь фракция пептид
Индекс интоксикации больных алкоголизмом, оцененный по определению поглощения фракции ТХУ - МСМ после диализа оказался почти вдвое ниже, чем у контрольной группы здоровых людей (рис.1 б). Вероятно, при диализе были удалены некоторые низкомолекулярные пептиды, содержащие ароматические аминокислоты и влияющие на поглощение при 280 нм.
ФМСФ - ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ - КП) - фермент, открытый в лаборатории М.Т. Генгина в лаборатории биохимии ПГПУ им.В.Г. Белинского [3, 4, 7, 9], вероятно относится к классу сериновых карбоксипептидаз. Было показано, что уровень ФМСФ - КП коррелирует с распределением биологически активных пептидов - гормонов. Предполагается, что этот фермент вовлечен в биосинтез и процессинг нейропептидов [2, 7, 8]. Так как многие проявления алкоголизма (возбуждение, эйфория, депрессии и т.п.) напрямую связаны с нарушением баланса нейропептидов, представляет интерес изучение влияния фракций МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом на активность ФМСФ - КП.
Фракции МСМ, полученные разными методами, оказывали различное действие на активность ФМСФ - КП. Наибольшие различия наблюдались при использовании фракции t - МСМ. Термостабильная пептидная фракция сыворотки крови здоровых людей оказывала значительное ингибирующее влияние на активность ФМСФ - КП (остаточная активность - 30 %, рис.2 а).
Вероятно, в сыворотке крови здоровых людей присутствуют ингибиторы протеиназ, контролирующие активность ферментов и уровень активных нейропептидов. При алкоголизме уровень этих ингибиторов снижается. Так, при добавлении термостабильной фракции сыворотки крови (t - МСМ) больных алкоголизмом в острой стадии алкогольного абстинентного синдрома (ААС) (группа 2) мы наблюдали лишь незначительное снижение активности ФМСФ - КП (остаточная активность - 85 %). В условиях терапии (ноотропы, седативные препараты, витамины и т.д.) ингибирующее влияние сыворотки крови больных алкоголизмом восстанавливалось, но не достигало высоких ингибирующих значений контрольной группы здоровых людей (рис. 2 а, группа 4).
а. б.
Рис.2. Влияние термостабильной фракции (t - МСМ) и ТХУ - МСМ фракции средних молекул сыворотки крови на активность ФМСФ - КП. Группа 1 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольного делирия (АД); группа 2 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольно-абстинентного синдрома (ААС); группа 3 - больные хроническим алкоголизмом с выраженными соматическими проявлениями (обострение хронических заболеваний, гепатоз, гепатит); группа 4 - больные, прошедшие курс комплексной терапии (инфузионная, антиседативные препараты, витамины, ноотропы, гепатопротекторы); контроль - группа клинически здоровых людей.
Отдельно среди наркологических больных была выделена группа людей с сочетанными патологиями - хронический алкоголизм, отягощенный гепатитом, почечной и сердечной недостаточностью (рис.2 а, группа 3). Фракция t - МСМ сыворотки крови больных 3 - й группы оказывала наибольший ингибирующий эффект на активность ФМСФ-КП (остаточная активность - 20 %). Вероятно, при длительном употреблении алкоголя нарушаются белок - синтезирующие функции печени, что приводит к дестабилизации компенсаторных механизмов, имеющих место в остром периоде заболевания.
На рис.2 б приведены результаты исследований по влиянию на активность ФМСФ - КП диализованной фракции сыворотки крови здоровых людей и больных алкоголизмом (ТХУ - МСМ). ТХУ - МСМ сыворотки крови здоровых людей оказывали активирующее влияние на ФМСФ-КП. Фракции ТХУ - МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом снижали активность ФМСФ - П в среднем на 20 % (рис.2 б).
Таким образом, фракции МСМ сыворотки крови, полученные разными способами (осаждение белков ТХУ и кипячение) не однозначно влияли на активность ФМСФ - КП.
Возможно, пептидные фракции сыворотки крови, полученные после осаждения белков разными способами, отличаются по соотношению пептидов различных молекулярных масс. Диализованнная ТХУ - МСМ - фракция содержит меньше низкомолекулярных пептидов (до 1000 КДА), чем недиализованная t - МСМ (удаление белков кипячением).
Также неоднозначно действуют МСМ - фракции сыворотки крови на активность карбоксипептидазы Н. КП Н - основной фермент процессинга нейропептидов, относится к классу карбоксипептидазо - В - подобных ферментов, катализирует реакцию отщепления положительно заряженных аминокислот с С - конца пептидов [2, 5, 8].
У здоровых людей фракция t - МСМ, содержащая преимущественно низкомолекулярные пептиды, оказывала ингибирующее действие на активность КП Н (остаточная активность - 29,7 %, рис.3 а), а диализированная фракция ТХУ - МСМ активировала КП Н (остаточная активность - 120 %, рис 3 б). Влияние t - МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом на активность КП Н прослеживалась более четко, чем влияние диализованных ТХУ - МСМ. У больных с проявлениями алкогольно - абстинентного синдрома наблюдается сильная активация КП Н при исследовании фракций t - МСМ, активация по сравнению с контролем прослеживается и у больных с АД, но гораздо слабее (рис.3 а, группы 2 и 1).
а. б.
Рис. 3. Влияние фракций t - МСМ и фракций ТХУ - МСМ сыворотки крови на активность КП Н. Группа 1 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольного делирия (АД); группа 2 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольно - абстинентного синдрома (ААС); группа 4 - больные, прошедшие курс комплексной терапии (инфузионная, антиседативные препараты, витамины, ноотропы, гепатопротекторы); контроль - группа клинически здоровых людей.1. Обнаружено, что пептидные фракции средних молекул (МСМ) сыворотки крови, полученные различными способами (осаждение белков ТХУ и кипячением) по - разному действуют на активность основных карбоксипептидаз - карбоксипептидазы Н и ФМСФ - ингибируемой карбоксипептидазы.
2. Трихлоруксусная кислота полностью ингибирует исследуемые карбоксипептидазы.
3. Фракция термостабильных МСМ сыворотки крови здоровых людей ингибирует карбоксипептидазу Н и ФМСФ - ингибируемую карбоксипептидазу.
4. При острых стадиях алкоголизма наблюдается снижение ингибирующего действия фракции t - МСМ сыворотки крови на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ - ингибируемой карбоксипептидазы.
5. В условиях терапии (ноотропы, седативные препараты) уровень ингибирующего действия пептидных фракций сыворотки крови возрастал, но не достигал значений, характерных для контрольной группы здоровых людей.
Список литературы
1. Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н.Н. Очистка и физико - химические свойства растворимой карбоксипептидазы Н из серого вещества головного мозга кошки // Биохимия. 1992, Т.57, № 11. - С.1712-1719.
3. Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. Частичная характеристика основной фенилметилсульфонилфторид - ингибируемой карбоксипептидазы из головного мозга кошки // Биохимия. 1995, Т.60, № 11. - С.1860 - 1866.
4. Вернигора А.Н., Щетинина Н.В., Генгин М.Т. Исследование активности основных (отщепляющих остатки аргинина и лизина) карбоксипептидаз у крыс разного возраста // Биохимия, 1996, Т.61, № 10. - С.1848 - 1856.
6. Генгин М. Т, Вернигора А.Н. Новая карбоксипептидаза процессинга энкефалинов нервной ткани животных // Укр. биохим. журн. 1989, т.61, N 3. - C.62 - 66.
7. Генгин М.Т., Вернигора А.Н. Ферменты процессинга опиоидных пептидов и методы определения их активности // Укр. биохим. журн. - 1994. - Т.66, № 2. - С.3 - 17.
8. Генгин М.Т. Новая карбоксипептидаза нервной ткани. Региональное распределение и некоторые физико-химические свойства // Нервная система. - Л.: - ЛТУ, 1991. - C.29 - 30.
9. Николайчик В.В. Молекулярные механизмы развития эндогенной интоксикации и совершенствование путей детоксикации: Автореф. дис. … д-ра мед. наук. - М., 1984.
10. Bondy C. A., Whitnall M. H., Brady L. S. Regulation of carboxypeptidase H gene expression in magnocellular neurons: response to osmotic stimulation // Mol. Endocrinol. - 1989. - V.3, № 12. - P. 2086 - 2092.
11. La Moel G., Strecker G., Guielle G. et al. // Artific.organs. - 1981. - Vol.4. - Suppl. - P.17 - 21.
12. Navarro J., Gerlier D., Touvaine J. et al. // Biomedicine. - 1979. - Vol.31. - P.261 - 264.