Исследование дикорастущего винограда, найденного на Северном Кавказе с использованием двух микросателлитных маркеров. Внутрипопуляционная изменчивость виноградной популяции. Vitis vinifera subsp. silvestris Gmel.: особенности селекции винограда.
Аннотация к работе
В ходе исследований генетического полиморфизма четырех популяций V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel. выявлено 15 микросателлитных вариантов, кодируемых 17 аллелями двух локусов. Параметры генетической изменчивости, включенные в анализ V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel. и рассчитанные по двум локусам, представлены в табл. Таблица 1 Частота встречаемости 17 аллелей двух микросателлитных локусов в популяциях V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel., собранных на Северном Кавказе Параметры генетической изменчивости (полиморфизм P, среднее число разных аллелей на локус (Na), эффективное число аллелей (Ne), Na - количество аллелей с частотой аллелей более 5%, информационный индекс Шеннона-Вивера (I), количество уникальных аллелей (NPA), количество общих аллелей, найденных у 25% и 50% (No of private Alleles<=25-50%) образцов в популяциях, средняя наблюдаемая (Ho) и (He) ожидаемая гетерозиготности) у популяций были примерно одинаковыми. Для этих популяций существует возможность смешивания с другими популяциями, однако, это не является достоверным, так как высока возможность присутствия нулевых аллелей.В ходе исследования можно сделать вывод, что микросателлитные маркеры позволяют разделить найденные генотипы дикого винограда на отдельные субпопуляции, однако вопрос, что данные субпопуляции являются действительно диким предком культурного винограда, а не одичавшими, остается открытым и требует дальнейшего детального исследования путем увеличения числа выборок и включением дикорастущих образцов из других ареалов.
Вывод
Теоретико-практическое использование генетического разнообразия требует предварительных знаний о структуре и количестве вариаций произрастающих популяций. Данная публикация отражает результаты первого генетического исследования и дифференциации образцов V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel. на Северном Кавказе.
В ходе исследований генетического полиморфизма четырех популяций V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel. выявлено 15 микросателлитных вариантов, кодируемых 17 аллелями двух локусов. Параметры генетической изменчивости, включенные в анализ V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel. и рассчитанные по двум локусам, представлены в табл. 1.
Таблица 1 Частота встречаемости 17 аллелей двух микросателлитных локусов в популяциях V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel., собранных на Северном Кавказе
Все локусы проявили высокий уровень полиморфизма в исследуемых популяциях. Наиболее часто встречающиеся аллели полиморфных локусов являются общими во всех субпопуляциях. Между субпопуляциями наблюдались отличия в содержании высокочастотных аллелей - VRZAG 79249, VRZAG 79235, VVMD 7238 и VVMD 7248 (табл. 1 и рис.). Также был выявлен диагностический признак - различия между субпопуляциями, которые определяются наличием в основном более редких аллелей. Например, аллели локусов VRZAG 79247, VRZAG 79253, VRZAG 79255, VRZAG 79257, VRZAG 79259, VRZAG 79271 и четыре аллеля локуса VVMD 7(232, 234, 244, 250), которые были обнаружены в исследуемых субпопуляциях один раз.
Таблица 2 Значение основных показателей генетической изменчивости дикого винограда V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel., собранных на Северном Кавказе
Популяции Na Ne Ho He F
Крымская - Pop1 3,000 3,000 1,000 0,625 -0,667
Абинская - Pop2 5,500 3,411 0,643 0,688 0,089
Майкопская - Pop3 2,500 1,973 0,625 0,422 -0,371
Горячий Ключ - Pop4 3,000 3,000 0,500 0,625 0,333
Среднее для вида в целом 3,500 (0,598) 2,846 (0,393) 0,692 (0,143) 0,590 (0,065) -0,154
Параметры генетической изменчивости (полиморфизм P, среднее число разных аллелей на локус (Na), эффективное число аллелей (Ne), Na - количество аллелей с частотой аллелей более 5%, информационный индекс Шеннона-Вивера (I), количество уникальных аллелей (NPA), количество общих аллелей, найденных у 25% и 50% (No of private Alleles<=25-50%) образцов в популяциях, средняя наблюдаемая (Ho) и (He) ожидаемая гетерозиготности) у популяций были примерно одинаковыми.
Уровень генетического полиморфизма в субпопуляциях дикого винограда довольно высокий: в среднем каждое растение гетерозиготно по 69,2% аллелям. Это согласуется с данными, полученными в других работах, так как виноград является высоко гетерозиготным растением, поэтому обладает большим внутри- и межвидовым полиморфизмом [13, 16]. Выявленная гетерозиготность варьировала Но от 0,500 до 1,000, со значением меньшим, чем для ожидаемого случайного взаимодействия гамет (He) во всех локусах, за исключением Крымской и Майкопской субпопуляций (рис.). Для этих популяций существует возможность смешивания с другими популяциями, однако, это не является достоверным, так как высока возможность присутствия нулевых аллелей. Предполагается, что большинство очевидных гомозигот могут быть гетерозиготами, один аллель будет видим, другой - нет. Эти типы нулевых аллелей могут появляться, когда мутации не позволяют связывать праймеры на нацеленный регион [11].
Рисунок 1 Средние значения аллельных вариантов, встречающихся у исследуемых популяций
Для исследования дифференциации также важным является выяснение процесса близкородственного скрещивания, который ведет к гомозиготизации, а, следовательно, к потере генетической изменчивости, поэтому для количественной оценки этого процесса был рассчитан коэффициент инбридинга (F). Он определяется как вероятность того, что при образовании зиготы очередного поколения в одном из ее локусов окажутся аллели, идентичные по происхождению, т.е. появившаяся особь будет по данному локусу аутозиготной. Идентичность по происхождению означает, что данные аллели являются копиями одной и той же аллели, находящиеся в генотипе одного из предков данной особи. Расчет показателей инбридинга Райта [14], которые отражают степень близкородственного скрещивания в популяциях, показали, что в субпопуляциях дикого винограда наблюдается избыток гетерозигот: индекс фиксации Райта (F) имеет довольно низкие положительные значения, за исключением популяции, произрастающей в Горячем Ключе (F = 0,333). Среднее значение индекса фиксации Райта (F) по всем популяциям равен -0,154. Ощутимый дефицит гетерозигот (F = 0,333, минимум F = 0,089) отмечен в популяциях Горячего Ключа и Крымской. Это говорит о том, что в данных популяциях возможен инбридинг, что также видно при исследовании показателей Но и He, которые практически совпадают, то есть находятся в состоянии генетического равновесия.
Внутрипопуляционная изменчивость у V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel. составляет 75,2%, тогда как на долю межпопуляционной изменчивости приходится 24,8% (FST = 0,248).
Таблица 3 Значение коэффициента F-статистики Райта для реликтовых популяций дикого винограда V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel., собранных на Северном Кавказе
Таким образом, проведенный сравнительный анализ показывает, что реликтовые популяции V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel., собранные на Северном Кавказе, отличаются высоким уровнем изменчивости.
Это говорит о том, что в данных популяциях возможен инбридинг, что также видно при исследовании показателей Но и He, которые практически совпадают то есть находятся в состоянии генетического равновесия. Очевидно, такая особенность характерна для популяций и можно объяснить диффузностью их ареала. Это приводило к усилению интенсивности миграции, изменению потока генов, повышению частоты их комбинаций. Ощутимый дефицит гетерозигот, отмеченный в популяциях, собранных в Горячем Ключе и Крымске, связан со слабым притоком генов извне, большинство скрещиваний в изолированных небольших реликтовых популяциях, длительно в ходе смен поколений, происходило внутри них. Естественный отбор способствовал повышению частот комбинаций генов, обеспечивающих лучшую приспособленность популяций к занимаемой территории. Такие комбинации генов могут определяться большей степенью неслучайности кроссинговера у растений реликтовых популяций, по сравнению с несколько генетически модифицированными, за счет более интенсивного обмена генами, растениями.
Очевидно, что реликтовые популяции, собранные в Горячем Ключе и Крымске, характеризуются определенной уникальностью генетической структуры и могут быть донорами генов устойчивости, которые прошли длительный эволюционный отбор.В ходе исследования можно сделать вывод, что микросателлитные маркеры позволяют разделить найденные генотипы дикого винограда на отдельные субпопуляции, однако вопрос, что данные субпопуляции являются действительно диким предком культурного винограда, а не одичавшими, остается открытым и требует дальнейшего детального исследования путем увеличения числа выборок и включением дикорастущих образцов из других ареалов.
Поэтому необходимо дальнейшее проведение генетического мониторинга популяции V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel. с увеличением ареала исследований и создание банка данных по их популяционно-генетической структуре. Это будет способствовать углублению познаний и усовершенствованию вопросов сохранения ценного генофонда подвида V. vinifera L. ssp. sylvestris Gmel. Северного Кавказа.
Список литературы
1. Звягин А.С., Трошин Л.П., Мухина Ж.М., Супрун И.И. Адаптация методики микросателлитного анализа для изучения генетического разнообразия сортов винограда Пино белый, Рислинг и их клонов // Новации и эффективность производственных процессов в виноградарстве и виноделии. - 2005. - Т. 2. - С. 113-117.
2. Трошин Л.П., Серпуховитина К.А., Носульчак В.А., Смурыгин А.С., Ильяшенко О.М., Панкин М.И. Мировой генофонд винограда на Кубани // Новации и эффективность производственных процессов в виноградарстве и виноделии. - 2005. - Т. II. - С. 124-131.
3. Трошин Л., Маградзе Д., Турок Й. Международное сотрудничество по сохранению генофонда винограда // Виноделие и виноградарство. - 2006. - № 2. - С. 24-25.
4. Arroyo-Garcia R., Lefort F., de Andres M.T., Ibanez J., Borrego J., Jouve N., Cabello F., Martinez Zapater J.M. Chloroplast microsatellite polymorphisms in Vitis species // Genome. - 2002. - V. 45. - № 6. - P. 1142-1149.
5. Bisson J. Essai de classement des cepages francais en ecogeogroupes phenotypiques. // J. Int. Sci. Vigne. Vin. - 1999. - 33: 105-110.
6. Bowers J.E., Dangl G.S., Meredith C.P. Development and characterization of additional microsatellite DNA markers for grape // Am. J. Enol. Vitic. - 1999. - V. 50 (3): 243- 246.
7. Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue // Focus. - 1990. - V. 12. - P. 13-15.
8. Fossati T., Labra M., Castiglione S., Failla O., Scienza A., Sala F. The use of AFLP and SSR molecular markers to decipher homonyms and synonyms in grapevine cultivars: the case of the varietal group known as “Schiave” // Theor. Appl. Genet. - 2001. - V. 102. - P. 200-205.
9. Hancock J.F. Temperate Fruit Crop Breeding: Germplasm to Genomics. - Springer Netherlands, 2008. - P. 197-231.
10. Peakall, R. and Smouse P.E. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population geneticsoftware for teaching and research // Molecular Ecology Notes. - 2006. - V. 6: 288-295.
11. Pollefeys P., Bousquet, J. Molecular genetic diversity of the French-American grapevine hybrids cultivated in North America // Genome. - 2003. - V. 46. - P.1037-1048.
12. Sefc K.M., Regner F., Turetschek E., Glossl J., Steinkellner H. Identification of microsatellite sequences in Vitis riparia and their applicability for genotyping of different Vitis species // Genome. - 1999. - V. 42. - P. 367-373.
13. Velasco R. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety / R. Velasco, A. Zharkikh, M. Troggio, D.A. Cartwright, A. Cestaro, D. Pruss, M. Pindo, L.M. FITZGERALD, S. Vezzulli, J. Reid, G. Malacarne, D. Iliev, G. Coppola, B. Wardell, D. Micheletti, T. Macalma, M. Facci, J.T. Mitchell, M. Perazzolli, G. Eldredge, P. Gatto, R. Oyzerski, M. Moretto, N. Gutin, M. Stefanini, Y. Chen, C. Segala, C. Davenport, L. Dematte, A. Mraz, J. Battilana, K. Stormo, F. Costa, Q. Tao, A. Si-Ammour, T. Harkins, A. Lackey, C. Perbost, B. Taillon, A. Stella, V. Solovyev, J.A. Fawcett, L. Sterck, K. Vandepoele, S.M. Grando, S. Toppo, C. Moser, J. Lanchbury, R. Bogden, M. Skolnick, V. Sgaramella, S.K. Bhatnagar, P. Fontana, A. Gutin, Y. Van de Peer, F. Salamini and R. Viola. // PLOS ONE. - 2007. - 2. - P. 1326.
14. Wright S. Evolution and the Genetics of Populations. Variability within and among natural populations. - Chicago: The University of Chicago Press, 1978. - V. 4. - P. 242-322.
15. Yeh, F.C. and Boyle, T.J.B. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits. // Belgian Journal of Botany. - 1997. - P. 129-157.
16. Zecca G., F. De Mattia, Lovicu G., Labra M., Sala F., Grassi F. Wild grapevine: silvestris, hybrids or cultivars that escaped from vineyards? Molecular evidence in Sardinia // Plant Biology. German Botanical Society and The Royal Botanical Society of the Netherlands. - 2009.