Проблемы повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Оценка качества семян по отношению к гибридам кукурузы. Использование метода электрофоретического анализа запасных белков семян в рамках процедуры обязательной сертификации семенного материала.
Аннотация к работе
Именно поэтому использование в рамках процедуры обязательной сертификации семенного материала метода электрофоретического анализа запасных белков семян является перспективным и востребованным на современном этапе. В результате заключение о принадлежности данной партии семян или посева к тому или иному сорту (гибриду, линии) можно сделать лишь с определенной долей вероятности. Электрофорезом с высокой достоверностью можно контролировать комбинации скрещивания любого гибрида кукурузы с момента передачи его в государственное сортоиспытание (эталонный паспорт гибрида) до того времени, когда гибрид будет модифицирован в процессе семеноводства, возможно даже и с улучшением урожайных качеств (фальсифицированный паспорт гибрида) [1]. Так, стоимость простых межлинейных гибридов оплачивалась в полном объеме только при условии, что уровень гибридности составлял не менее 95%; при гибридности от 94 до 90% цена пропорционально уменьшалась на 3% за каждый процент снижения гибридности. Для двойных межлинейных и трехлинейных гибридов, при показателях гибридности до 85% и выше, семена оплачивались в полном объеме стоимости, при гибридности 84-80% цена уменьшалась на 3% за каждый процент снижения гибридности.Установлена положительная динамика уровня гибридности кукурузы поступающих в Республику Беларусь гибридов в течение последних семи лет. Установлено, что белковые маркеры гибридности проявляются в большей степени по отцовским родительским формам гибридов.
Введение
Повышение урожайности сельскохозяйственных культур во многом зависит от качества используемых семян. Проблема объективной, c высокой точностью оценки качества семян сельскохозяйственных культур в последнее время становится особенно актуальной. Наиболее востребованными вопросы контроля качества семян выступают по отношению к гибридам кукурузы и их родительским компонентам. Прежде всего качество семян приобретает особое значение, когда речь идет о гибридности или типичности кукурузы.
Высокая стоимость гибридных семян кукурузы, их родительских компонентов, особенно приобретаемых у зарубежных производителей, требует применения точных методов оценки качества семян, наиболее приближенных к уровню генотипа и неподверженных модификационной изменчивости.
Именно поэтому использование в рамках процедуры обязательной сертификации семенного материала метода электрофоретического анализа запасных белков семян является перспективным и востребованным на современном этапе.
Анализ источников
В настоящее время в Республике Беларусь в области лабораторного контроля качества семенной продукции активно используются несколько типов маркерных систем: морфологические признаки, биохимические и молекулярные маркеры. Для регистрации генетических ресурсов, установления идентификационных критериев используется маркерная система на основе морфологических признаков. Благодаря наличию значительного разнообразия морфологических признаков у большинства возделываемых культур данный тип идентификации позволяет проводить как маркирование хозяйственно-ценных признаков, так и идентификацию материала.
Проявление морфологических признаков часто существенно зависит от условий выращивания, подвержено модификационной изменчивости и в ряде случаев уже не может быть использовано в качестве критерия идентификации. При этом фенотипическое выражение признака уже может не соответствовать нужному генотипу, что приводит к некорректным выводам.
В результате заключение о принадлежности данной партии семян или посева к тому или иному сорту (гибриду, линии) можно сделать лишь с определенной долей вероятности. К тому же это требует дополнительных затрат времени и средств. Еще одним существенным недостатком морфологических маркеров является то, что многие из них полигенны по своей природе [8]. Особенно актуальной данная проблема стала в последнее время в связи с введением в Республике Беларусь процедуры обязательной сертификации всего семенного материала.
Метод электрофоретического анализа в условиях Республики Беларусь применяется как для первичного анализа при поступлении семенного материала на территорию республики, так и на завершающем этапе, после проведения общепринятых процедур лабораторного сортового контроля. Особенно актуально применение данного метода оценки в случае арбитражных разбирательств в области качества семян. Метод активно используется для определения и структуры сорта, сортовой принадлежности, сортовой чистоты, генетической конституции, гибридности семян, защиты прав патентообладателей сортов.
До недавнего времени основным методом, на основе которого определялось качество полученных гибридных семян, являлся грунт-контроль. Однако при любом способе его проведения (в полевых условиях, в условиях искусственного климата) требуются значительные временные и трудовые ресурсы. В связи с этим поиск новых методов оценки качества семенного материала, обладающих как объективностью результатов, так и наименьшей затрачиваемостью, является актуальным и на сегодняшний день.
Кроме этого, по результатам сравнительного анализа результатов грунт-контроля и электрофореза запасных белков была выявлена существенная разница между результатами тестирования различных методов и приоритет отдан результатам на основе метода молекулярного маркирования [5, 7].
На основе современного уровня знаний о белках и нуклеиновых кислотах был открыт принцип маркирования генетических систем организма. Он основан на том, что каждый белок - первичный, уникальный продукт экспрессии гена (наследственность организма), который является обязательным составляющим любой клетки. Именно применение белковых маркеров является фактором идентификации гибридов и линий кукурузы. Кроме того, электрофоретический метод принят в качестве стандартного метода решением Международной ассоциации по испытанию семян, объединенный под эгидой ISTA [3, 4].
Электрофоретические спектры запасных белков специфичны не только для сорта, гибрида, но и для отдельных линий, биотипов внутри определенного сорта. Такая особенность генетически детерминированного белкового признака, каким является электрофоретический спектр, не связана с условиями среды, что определяет его надежность и точность [3].
Маркирование по спектру компонентов зеина дает возможность проводить такую оценку на предмет определения полноты скрещивания. Являясь по сути гибридным, спектр зеина включает компоненты обоих родителей - в нем суммированы спектры материнской и отцовской линий.
Благодаря кодоминантному характеру наследования белковых компонентов, метод также позволяет в большинстве случаев вскрывать причины, вызвавшие отклонения от заявленных характеристик (например, степень генетической однородности инбредных линий, реально использованных для получения гибридов; процент материнских генотипов в гибридной партии; наличие специфического генетического материала от других селекционных линий с определенными характеристиками, использованными при получении гибридов, и т.д.) [4].
Электрофорезом с высокой достоверностью можно контролировать комбинации скрещивания любого гибрида кукурузы с момента передачи его в государственное сортоиспытание (эталонный паспорт гибрида) до того времени, когда гибрид будет модифицирован в процессе семеноводства, возможно даже и с улучшением урожайных качеств (фальсифицированный паспорт гибрида) [1].
Методы исследования
Лабораторные испытания семян кукурузы проводились Испытательной лабораторией качества семян УО БГСХА, соответствующей критериям системы аккредитации Республики Беларусь и международным требованиям по СТБ ИСО / МЭК 17025-2007.
Проведение электрофоретического анализа запасного белка кукурузы - зеина, идентификацию и интерпретацию результатов полученных белковых спектров проводили согласно СТБ 1710-2006 «Семена кукурузы. Метод определения уровня гибридности семян первого поколения, оценка типичности и маркирование инбредных линий» [2] .
Для получения модельных матриц исходных родительских линий использовали оригинальные образцы (эталонные электрофореграммы), предоставленные учреждениями-оригинаторами гибридов. В качестве материала для исследований использовались гибриды кукурузы (простые, двойные межлинейные, трехлинейные, простые модифицированные), родительские формы гибридов (простые гибридные комбинации, самоопыленные линии) различных регионов селекции, поступающие в Республику Беларусь.
Основная часть урожайность кукуруза гибрид электрофоретический
Нормативно-правовая база применения метода электрофоретического анализа для контроля качества семян кукурузы на территории Республики Беларусь в полной мере регламентирована с момента введения в действие в 2006 г. СТБ 1710-2006 «Семена кукурузы. Метод определения уровня гибридности семян первого поколения, оценка типичности и маркирование инбредных линий» [2].
Эффективность проводимых исследований и значимость принятия Государственных стандартов на применяемый метод контроля можно наглядно продемонстрировать полученными результатами за годы работы испытательной лаборатории.
Приведенные восьмилетние данные (рис.) по количеству партий гибридов кукурузы с показателями гибридности ниже значений, установленных в нормативных документах, позволяют оценить динамику и однонаправленное изменение показателя. Присутствует довольно четкая тенденция постоянного уменьшения количества партий гибридов с пониженным уровнем гибридности. Особенно это относится к трехлинейным гибридам, имеющим наибольший удельный вес в общем объеме используемых гибридов на территории республики.
Рис. Динамика количества партий гибридов кукурузы с показателями, ниже установленных в нормативных документах
Учитывая высокую результативность и объективность результатов электрофоретического анализа зеина, на основе имеющихся практических данных [6] и реальных генетических характеристик гибридов кукурузы Министерством сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь ранее были установлены требования по отношению к оплате закупаемых гибридных семян кукурузы согласно их качеству. Так, стоимость простых межлинейных гибридов оплачивалась в полном объеме только при условии, что уровень гибридности составлял не менее 95%; при гибридности от 94 до 90% цена пропорционально уменьшалась на 3% за каждый процент снижения гибридности. Для двойных межлинейных и трехлинейных гибридов, при показателях гибридности до 85% и выше, семена оплачивались в полном объеме стоимости, при гибридности 84-80% цена уменьшалась на 3% за каждый процент снижения гибридности. Семена с уровнем гибридности ниже 80% не допускались к использованию.
Начиная с 2011 г. ко всем закупаемым гибридам кукурузы установлен нижний порог уровня гибридности на уровне 95%, для отцовских родительских форм простых и трехлинейных гибридов - типичность не ниже 99%. В этой связи интересно проследить динамику изменчивости в уровне гибридности семян кукурузы зарубежной селекции (табл. 1).
Таблица 1. Средние показатели уровня гибридности кукурузы зарубежной селекции (%) по результатам испытаний 2004-2011 гг.
Наименование гибрида Год проведения оценки
2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
Бемо 182 СВ 88 90 91 92 90 94 - 96
Молдавский 257 СВ 86 89 91 90 92 91 90 95
Бемо 172 СВ 87 88 87 91 91 92 - -
Немо 216 СВ 86 86 88 91 90 90 90 -
Мускат 87 89 89 90 91 91 - -
Порумбень 174 СВ - 89 91 92 92 92 91 -
Порумбень 212 СВ 85 88 87 90 95 90 92 95
Порумбень 176 МВ - - - - 98 96 - 97
Кремень 200 СВ - - - - - 95 96 96
Красноларский 194 МВ - - - 90 91 92 90 -
РОСС 199 МВ - - - 88 96 96 - -
Примечание: пробы не анализировались
Как свидетельствуют данные, на протяжении восьми лет изучения поступающих в Республику Беларусь гибридных форм кукурузы средние показатели гибридности находились на довольно высоком уровне. Более того, в последние 3-4 года прослеживается явная тенденция к увеличению величин показателей гибридности ввозимых в Республику Беларусь семян кукурузы.
Следует отметить, что визуальная идентификация гибридности на основе белковых спектров районированных на территории Беларуси гибридов имеет свои особенности, обусловленные различием в проявлении белковых маркеров гибридности (табл. 2). Прежде всего это относится к процедуре идентификации трехлинейных гибридов.
Таблица 2. Характер маркирования уровня гибридности гибридов кукурузы и их родительских компонентов
Наименование гибрида, родительской формы Тип гибрида, родительской формы Количество маркеров гибридности по формам Общее число белковых маркеров гибридности
В результате практической работы установлено, что у 80% анализируемых трехлинейных гибридов отцовская форма имеет четко выраженные маркерные компоненты по сравнению с материнским простым гибридом, выявляемые в основном в зоне средней миграции молекулярных форм зеинового комплекса.
Основную проблему вызывают трехлинейные гибриды, не имеющие четкого отличительного маркера по отношению к материнской форме. В ряде случаев идентификация таких форм основывается на принципах поиска отличных компонентов отцовской формы по сравнению с каждой самоопыленной линией, составляющей материнский простой гибрид [2, 9].
Однако встречаются такие формы, для которых отцовская родительская форма не выявляет отличительных компонентов по сравнению с материнскими формами, в таком случае идентификацию маркеров гибридности проводят на основе дополнительных компонентов материнских форм. Анализу в данном случае подлежат не отличительные отцовское маркеры гибридности, а гомозиготы отличительных материнских компонентов, полученные от самоопыления или сестринского опыления.
Как свидетельствуют полученные данные, все из проанализированных гибридов кукурузы имеют зеиновые маркеры гибридности разной представленности. В то же время установлена специфика их распределения по родительским компонентам гибридов и типу гибрида.
Для большинства гибридов белковые маркеры гибридности обусловлены в основном отцовскими родительскими формами. Исключением является двойной межлинейный гибрид Адонис 224 СВ, оценка уровня гибридности которого возможна за счет белковых маркеров как отцовской, так и материнской форм.
Установлено, что по всем проанализированным гибридам количество маркерных белковых позиций преобладает в зоне средней миграции зеинового комплекса (электрофоретическая подвижность rf в пределах от 0,4 до 0,6).
В отношении гибрида Якуб установлено, что белковые маркеры гибридности могут быть идентифицированы только за счет материнской формы.
Проведенный анализ электрофоретических спектров зеина родительских форм выявил свои особенности в характере проявления маркеров гибридности.
Следует отметить, что хотя все анализируемые формы представляют собой простые гибриды, однако они выявляют неравнозначность в проявлении маркеров гибридности как по генотипу родителей, так и по зонам электрофоретического спектра. Особое внимание обращают на себя простые гибриды Сирена С, Кросс 220 С, по которым белковые маркеры гибридности определяются только по отцовской форме. По остальным формам отмечено увеличение общего количества зеиновых маркеров гибридности по зонам белкового спектра (зонам миграции).
В отношении родительских компонентов гибридов, кроме установленных белковых маркеров гибридности, нами был выявлен еще ряд дополнительных особенностей в отношении характеристик белкового спектра и генетической структуры. Это относиться к отцовским формам трехлинейных гибридов, представляющим собой самоопыленные линии.
Было установлено, что целый ряд таких форм характеризуется выраженной генетической разнородностью, представленной наличием нескольких типов (биотипов, белковых профилей), имеющих четкие белковые отличительные признаки.
Кроме того, они характеризуются достаточно широким диапазоном варьирования молекулярных форм зеинового комплекса в сравнении с биотипами самоопыленных линий между собой.
Особенно четко межбиотипные отличия по родительским формам наблюдаются в случаях, когда в их создании участвуют несколько сестринских линий с модификациями-заменами одной из сестринских форм. Такую же особенность проявляют и некоторые из проанализированных простых модифицированных гибридов (табл. 3).
Компонент гибрида Число компонентов белкового спектра Сумма маркеров гибридности
" 18 0
"" 22 4
> 16 3
F1 22 -
Известно, что модифицированные гибриды - это потомство первого поколения, полученное от скрещивания гибридной комбинации двух родственных линий (А ? А1) с самоопыленной линией (В), т.е. формула модифицированного гибрида выглядит следующим образом: [(А ? А1) ? В].
Если исходить из этого определения, то уровень гибридности у модифицированных гибридов следует определять по формуле, используемой для оценки уровня гибридности простых гибридов: (1) где S - количество «гибридных» ЭФ спектров, шт.; N - количество анализируемых зерновок, шт. (равное 100 шт.).
Следует отметить, что использование данной формулы правомерно только в том случае, если предварительно было получено электрофоретическое доказательство идентичности зеиновых спектров сестринских линий (А и А1) материнской формы модифицированного гибрида (на основе эталонных электрофоретических матриц, оригинальных семян сестринских линий).
Однако в процессе производства семян родительских форм интересуемого модифицированного гибрида семеноводы и сами селекционеры, стремясь увеличить урожайность материнской гибридной комбинации, вносят существенные модификации-замены одной из сестринских форм. В этом случае обязательна процедура проверки электрофоретических спектров исходных родительских линий материнской гибридной комбинации изучаемого модифицированного гибрида. Только в данном случае метод электрофореза зеина будет объективным арбитром качества работы и корректности в соблюдении исходной селекционной формулы данного простого модифицированного гибрида.
Если полученные электрофореграммы сестринских линий будут характеризоваться несколькими типами белковых профилей (белковых биотипов), это означает, что родительские линии материнской формы (А и А1) не являются родственными и в этой новой комбинации, возникшей по самостоятельной инициативе создателей или производителей родительских форм, анализируемый простой модифицированный гибрид становится трехлинейным гибридом, уровень гибридности которого уже следует оценивать по другой формуле: (2) где М - количество ЭФ спектров обнаруженных гомозигот, шт.; N - общее количество анализируемых зерен, шт. (равное 200 шт.).
Основываясь на результатах нашей работы, можно констатировать, что анализ и идентификация результатов электрофореза по простым модифицированным гибридам в большинстве своем проводится с учетом того, что используемые материнские сестринские линии обладают идентичными характеристиками белковых спектров зеина. Поэтому уровень гибридности определяется в соответствии с критериями, применимыми к расчетам для простых гибридов.
Однако встречаются материнские формы модифицированных гибридов, включающие неидентичные по зеиновому комплексу сестринские линии, и оценка показателя гибридности в данном случае будет проводиться как для трехлинейного гибрида.
Таким образом, использование стандартизированного метода контроля качества семян кукурузы на основе белковых маркеров позволяет надежно контролировать параметры, определяемые нормативными документами на семенной материал, оценивать генетические особенности используемых форм кукурузы для формулирования корректных выводов о качестве.
Введение стандартизированных методик в области контроля качества семян в условиях Республики Беларусь проводится для того, чтобы дать каждому производителю четкое понимание, какие требования к продукции и процессу производства он должен выполнить, а потребителю - уверенность в том, что он пользуется качественным продуктом.
Использование методик уровня государственных стандартов в области контроля качества семенной продукции при осуществлении международной торговли должно обязательно реализовываться по принципу: один стандарт, одно измерение, один и тот же подход.
Только в этом случае можно гарантировать сопоставимость и воспроизводимость конечного результата испытания семян (гибридность, типичность, сортовая чистота, сортовая идентификация и т.п.) в условиях профильных лабораторий различных государств. Реализация этого принципа должна происходить через гармонизацию, соответствие требований, совершенствование законодательства в области семенного и сортового контроля, гармонизацию стандартов, унификацию методик, взаимное признание результатов.
Вывод
1. Установлена положительная динамика уровня гибридности кукурузы поступающих в Республику Беларусь гибридов в течение последних семи лет.
2. Определены достаточно высокие показатели уровня гибридности семян кукурузы молдавской селекции, репродуцируемые в условиях республики.
3. Установлено, что белковые маркеры гибридности проявляются в большей степени по отцовским родительским формам гибридов.
4. Показано, что большинство маркеров гибридности находится в зоне средней миграции зеинового комплекса в белковом спектре кукурузы.
5. Выявлена генетическая неоднородность ряда родительских форм гибридов, в том числе с участием сестринских линий у простых модифицированных гибридов.
(Поступила в редакцию 15.06.11)
Список литературы
1. Воронин, А.Н. Гибридность семян кукурузы и урожай / А.Н. Воронин, Н.С. Сокорев, П.М. Авраменко // Кукуруза и сорго. 2004. №6. С. 12-13.
2. Семена кукурузы. Метод определения уровня гибридности семян первого поколения, оценка типичности и маркирование инбредных линий: СТБ 1710-2006. Утв. и введ. в действие Постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 30 декабря 2006 г. №66. Минск, 2006. 11 с.
3. Конарев, В.Г. Белки растений как генетические маркеры / В.Г. Конарев. М.: Колос, 1983. 320 с.
4. Конарев, А.В. Использование молекулярных маркеров в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции / А.В. Конарев // Аграрная Россия. 2006. №6. С. 4-22.
5. Малахова, М.С. Соответствие результатов оценки генетической однородности семян подсолнечника методами грунт-контроля и электрофореза запасных белков / М.С. Малахова, А.Ф. Першин // Сб. науч. тр. Ин-та масличных культур Запорожья, 1999. Вып. 4. С. 7-13.
6. Пожога, В.Н. Рекомендации по возделыванию кукурузы в Молдове / В.Н. Пожога. Пашкань, 1996. 35 с.
7. Попереля, Ф.О. Генетическая интерпертация электрофореграмм гелиантина семян F1 подсолнечника / Ф.О. Попереля // Цитология и генетика. 2000. Т. 36. №2. С. 84-90.
8. Рамазанова, С.А. Идентификация сортов сои с использованием молекулярно-генетических методов: дисс. ... канд. биол. наук: 06.01.05 / С.А. Рамазанова; Кубан. гос. аграр. ун-т. Краснодар, 2008. 107 с.
9. Комарова, Г.Е. Проявление эффекта гетерозиса у кукурузы на уровне белковых маркеров / Г.Е. Комарова, [и др.] Stiinta agricola. №2. 2007. С. 11-15.