Изучение иммунометаболических и гепатопротекторных эритроцитзависимых эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз, протеаз и витаминов при острой кровопотере. Эффект взаимодействия гликозаминогликанов с водо- и жирорастворимыми витаминами.
Аннотация к работе
Кровопотеря сопровождается увеличением числа ретикулоцитов и снижением количества зрелых эритроцитов в периферической крови, изменением деформируемости этих клеток, снижением числа тромбоцитов, повышением их адгезивных и агрегативных свойств (Соловьев С.В., 1989). Иммунометаболические эффекты гликозаминогликанов различного видового происхождения и гликозидаз («Лидазы» и «Лизоцима») при кровопотере усиливаются жиро-(«Ретинола ацетат», «Токоферола ацетат», «Викасол», «Менадион») и водорастворимыми витаминами («Пиридоксина гидрохлорид», «Фолиевая кислота», «Цианкобаламин»). Папаин не влияет, а лизоцим или террилитин по отдельности, в большей степени в сочетании с витаминами, повышают ФМА нейтрофилов и иммунную реактивность крыс после кровопотери. Обнаружены иммуномодулирующие свойства стромы эритроцитов, индуцированной лизоцимом или террилитином, полученной после кровопотери и обработанной кобаламином. Основные положения диссертации представлены на конференциях Курского государственного медицинского университета: конференциях, посвященных 65 и 66-летию КГМУ «Актуальные проблемы медицинской науки и фармации» (Курск, 2000, 2001), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2000), VII и X Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2000, 2003), Международной научно-практической конференции «Современные технологии фитонутрициологии в акушерстве, гинекологии и педиатрии» (Москва, 2003), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007), на совместном заседании кафедр фармакологии, фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии, биохимии, спортивной медицины и медицинской реабилитации, акушерства и гинекологии, акушерства и гинекологии ФПО, микробиологии и патофизиологии Курского государственного медицинского университета (2008).Потеря 2% крови угнетала развитие ГИО и ГЗТ, подавляла функционально-метаболическую активность лейкоцитов периферической крови, снижала содержание БФГ, АТФ, активность СОД и ГР в эритроцитах, повышала концентрацию АГП и МДА, активность АЛТ, АСТ, ААП, АМГ, ЩФ и содержание ОБ в плазме крови. После инкубации с ГАГ-Р, эритроциты интактных крыс приобретали свойство стимулировать развитие иммунного ответа у здоровых животных и крыс после кровопотери, причем, наиболее выраженными иммуномодулирующими свойствами обладали эритроциты, инкубированные в среде, содержащей 3 мг/мл ГАГ-Р. Инкубация с ГАГ-Р не индуцировала у эритроцитов, полученных у КПК после кровопотери свойства модулировать развитие гуморального иммунного ответа у здоровых животных и крыс, потерявших 2% крови. Оказалось, что введение стромы, обработанной ГАГ-Р в дозе 2 мг/мл до или после кровопотери, вызывало слабо выраженный иммуномодулирующий эффект, а инъекции стромы, инкубированной с менадионом или с ГАГ-Р в дозе 1 и 3 мг/мл - не влияли на выраженность иммунной реакции, индуцированной ЭБ. Установлено, что фракция I супернатантов прилипающих при температуре 32-37°С спленоцитов, выделенных после кровопотери, при введении КПК крысам, не получавшим лизоцим, вызывала снижение содержания ДК и МДА, активность АЛТ и ACT, а также усиливала иммунный ответ на ЭБ, фракция II была неактивной, а фракция III стимулировала иммунную реакцию на ЭБ, но не влияла на содержание продуктов ПОЛ и активность ферментов в крови реципиента (рис.Острая 2% кровопотеря повышает показатели, характеризующие перекисное окисление липидов, снижает в эритроцитах содержание в эритроцитах макроэргических соединений и активность антиоксидантных ферментов, фагоцитарно-метаболическую активность полиморфноядерных лейкоцитов, угнетает развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, индуцирует появление у легких эритроцитов иммуносупрессирующих свойств. Гликозаминогликаны, выделенные из растений семейств Astraceae, Tiliaceae и Poligonaceae, при внутрижелудочном и внутримышечном введении без и после острой кровопотери стимулируют фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофилов, развитие гуморального и клеточного иммунного ответа. Выраженный иммуномодулирующий эффект после острой кровопотери вызывает совместное применение гликозаминогликанов животного происхождения (препарат «Дона») и водорастворимых витаминов - пиридоксина и кобаламина. Гликозаминогликаны сенсибилизируют эритроциты к взаимодействию с кобаламином, а пиридоксин повышает чувствительность иммуноцитов к взаимодействию с модифицированными гликозаминогликанами и кобаламином. Введение препаратов гликозидаз (лидазы или лизоцима) в норме и после острой кровопотери повышает функционально-метаболическую активность нейтрофилов, усиливает формирование гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа.
Вывод
Иммуномодулирующее действие жирорастворимых витаминов и гликозаминогликанов при кровопотере. Внутрижелудочное введение ГАГ, выделенных из растений семейства Teliaceae, Asteraceae и Polygonaceae (ГАГ-Т, ГАГ-А и ГАГ-Р) интактным крысам не влияло на развитие у них ГИО и ГЗГ, индуцированных ЭБ. Внутримышечное введение ГАГ интактным животным стимулировало развитие ГИО, но не влияло на ГЗГ. Наиболее выраженный стимулирующий эффект вызвало введение ГАГ-Р.
Потеря 2% крови угнетала развитие ГИО и ГЗТ, подавляла функционально-метаболическую активность лейкоцитов периферической крови, снижала содержание БФГ, АТФ, активность СОД и ГР в эритроцитах, повышала концентрацию АГП и МДА, активность АЛТ, АСТ, ААП, АМГ, ЩФ и содержание ОБ в плазме крови. По-видимому, после потери 2% крови иммуносупрессирующий эффект вызываемый повышением интенсивности ПОЛ усиливается нарушением функций гепатоцитов и накоплением в крови ААП и АМГ, обладающих выраженными иммуносупрессорными свойствами (Прокопенко Л.Г. и др., 1998).
Установлено, что внутримышечное и внутрижелудочное введение ГАГ-Р в сочетании с РА или ТА корригирует ГИО и ФМА нейтрофилов и не влияет на развитие ГЗТ. Комбинированное применение ГАГ-Р и филлохинона или менадиона частично или полностью корригирует клеточный и гуморальный иммунный ответ и ФМА полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови КПК (табл. 3).
После кровопотери легкие эритроциты приобретали иммуносупрессирующие свойства. Введение ГАГ-Р и менадиона ослабляло иммуносупрессирующие свойства легких эритроцитов и индуцировало появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых клеток. Полученные данные свидетельствуют о существенной роли эритроцитов в реализации иммуномодулирующего действия совместного применения ГАГ и менадиона при кровопотере.
Таблица 3
Влияние сочетанного применения гликозаминогликанов растительного происхождения с жирорастворимыми витаминами на иммунитет крыс после кровопотери
№ п/п Условия опыта ГИО ГЗТ Функциональная активность нейтрофилов
1. Кровопотеря Угнетение Угнетение Угнетение
2. Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Polygonaceae и ретинола ацетата Коррекция Нет эффекта Коррекция
3. Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Polygonaceae и токоферола ацетата Коррекция Нет эффекта Коррекция
4. Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Polygonaceae и филлохинона Нормализация Нормализация Нормализация
5. Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Polygonaceae и менадиона Нормализация Коррекция Нормализация
Иммуномодулирующее действие гликозаминогликанов Polygonaceae и менадиона, иммобилизованных стромой эритроцитов после кровопотери. Наиболее простым способом фиксации лекарственных препаратов на нерастворимом в водной фазе носителе является адсорбция их на цитоплазматической мембране эритроцитов. Известно, что инкубация эритроцитов в растворах, содержащих ферменты и фосфолипиды, приводила к появлению у этих клеток иммуномодулирующих свойств (Прокопенко Л.Г. и др., 1998). Выраженное влияние на иммуномодулирующие свойства эритроцитов оказывает менадион. Принимая во внимания изложенное, были изучены иммуномодулирующие свойства ГАГ-Р и менадиона соиммобилизованных на эритроцитах и их строме.
После инкубации с ГАГ-Р, эритроциты интактных крыс приобретали свойство стимулировать развитие иммунного ответа у здоровых животных и крыс после кровопотери, причем, наиболее выраженными иммуномодулирующими свойствами обладали эритроциты, инкубированные в среде, содержащей 3 мг/мл ГАГ-Р.
Инкубация с ГАГ-Р не индуцировала у эритроцитов, полученных у КПК после кровопотери свойства модулировать развитие гуморального иммунного ответа у здоровых животных и крыс, потерявших 2% крови. Полностью неактивными были также эритроциты инкубированные с менадионом. Эти наблюдения показывают, что после кровопотери мембрана эритроцитов становится рефрактерной к раздельному действию ГАГ-Р и менадиона.
Принимая во внимание изложенное, было изучено иммуномодулирующее действие стромы эритроцитов интактных крыс, экстракорпорально обработанной ГАГ-Р или менадионом.
СЭОГ и СЭОМ стимулировала развитие иммунного ответа на ЭБ у здоровых животных. Наиболее выраженная стимуляция имела место при введении частиц, полученных при содержании в инкубационной среде 2 и 3 мг/мл ГАГ-Р. После кровопотери СЭОГ повышала, но не до уровня контрольной группы, а СЭОМ - не влияла на развитие различных форм иммунного ответа на ЭБ. Изучена также иммуномодулирующая активность стромы эритроцитов, полученных после кровопотери и инкубированной с ГАГ-Р или менадионом. Оказалось, что введение стромы, обработанной ГАГ-Р в дозе 2 мг/мл до или после кровопотери, вызывало слабо выраженный иммуномодулирующий эффект, а инъекции стромы, инкубированной с менадионом или с ГАГ-Р в дозе 1 и 3 мг/мл - не влияли на выраженность иммунной реакции, индуцированной ЭБ. На основании этих экспериментов можно прийти к заключению, что компоненты структуры стромы эритроцитов крыс, потерявших 2% крови, в процессе гемолиза претерпевают изменения, ослабляющие или предотвращающие взаимодействия с ними изученных соединений.
Принимая во внимание то обстоятельство, что цельные тяжелые эритроциты, инкубированные с ГАГ-Р, приобретают иммуностимулирующие свойства, а клетки, обработанные аналогичным образом менадионом, остаются иммунологически неактивными, возникло предположение, что инкубация СЭОМ с ГАГ-Р повысит стабильность и увеличит иммуномодулирующую активность стромальных частиц. Для проверки этого предположения СЭОМ, полученные на основе клеток интактных животных и крыс, подвергнутых кровопусканию обрабатывали in vitro ГАГ-Р 2 мг/мл и полученные частицы (СЭОМГ) вводили животным до или после кровопотери.
Оказалось, что СЭОМГ интактных крыс стимулировала развитие иммунного ответа у здоровых животных в значительно большей степени, чем СЭОГ. Об этом свидетельствовал тот факт, что у животных, получавших инъекции СЭОГ, количество АОК в селезенке было в 3,2 раза выше, чем в контроле, а у крыс, которым вводили СЭОМГ, эти параметры превышали контрольный уровень соответственно в 4,9 и 3,5 раза (табл. 4). В отличие от СЭОГ, СЭОМГ нормализовал развитие иммунного ответа после кровопотери. Принципиально важным является тот факт, что СЭОМГ, полученный на основе клеток, выделенных после кровопотери в отличие от СЭОГ стимулирует развитие гуморальной иммунной реакции на ЭБ у здоровых и КПК (табл. 4).
Таблица 4
Влияние стромы эритроцитов интактных животных и КПК, последовательно обработанной меналионом и ГАГ-Р, на развитие иммунного ответа у здоровых животных и КПК
№ п/п Условия опыта Здоровые животные КПК
АОК РМЛ АОК РМЛ
1. Контроль (без введения стромы) 25,4±2,7 5,7±0,5 7,1±0,9 2,3±0,2
2. Введение СЭОГ интактных животных 81,3±8,4*1 9,1±1,0*1 16,4±1,8*1 3,9±0,3*1
3. Введение СЭОМГ интактных животных 124,5±14,3*1,2 8,8±0,9*1,2 27,0±2,9*1,2 5,2±0,5*1,2
Примечание: здесь и на последующих таблицах: 1. * - p<0,05; 2. - цифра рядом со звездочкой указывает на группу, по отношению к которой различия достоверно.
Таким образом, обработка стромы эритроцитов менадионом повышает чувствительность ее структур к модифицирующему действию ГАГ-Р. Механизм этого эффекта остается неясным. Можно лишь предположить, что при взаимодействии менадиона с соединениями стромы эритроцитов, образуются структуры, модифицирующие состояние фосфолипидного каркаса мембраны эритроцитов и повышающие эффективность связывания с ними ГАГ-Р.
Иммуномодулирующее действие модифицированных лекарственными соединениями эритроцитов обусловлено цитокинами, выделяемыми моноцитарно-макрофагальными и лимфоидными клетками селезенки (Конопля Н.А., 2001). Не исключено, что аналогичный механизм реализуется при введении в организм модифицированной стромы эритроцитов. Для проверки этого предположения клетки селезенки крыс, подвергнутых кровопусканию и получавших инъекции СЭОМГ, фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре среды, культивировали в течение 6 ч, получали супернатант и тестировали его на наличие иммуномодулирующей активности. Установлено, что супернатант клеток, прилипающих к стеклу при 4-10 ?С супрессирует у аллогенных животных развитие иммунного ответа на ЭБ. Супернатант неприлипающих клеток увеличивает выраженность иммунной реакции, но в меньшей степени, чем супернатант прилипающих при 32-37?С клеток (табл. 5).
Фракция III супернатанта неприлипающих клеток при аллогенном переносе стимулировала развитие иммунного ответа на ЭБ в такой же степени, как и содержащий ее объем нефракционированного супернатанта. Остальные фракции супернатанта неприлипающих клеток не влияли на выраженность реакции индуцированной ЭБ. Фракция II клеток, прилипающих при 4-10 ?С, обладала иммуносупрессирующей активностью, а фракция III клеток, прилипающих при 32-37 °С - иммуностимулирующими свойствами.
Клетки моноцитарно-макрофагального ряда выделяют пептиды, оказывающие влияние не только на функциональную активность иммуноцитов, но обладающие также антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами (Кетлинский С.А. и др., 1992). Определение антиоксидантной и гепатопротекторной активности прилипающих и неприлипающих клеток селезенки крыс, потерявших 2% крови, получавших инъекции СЭОМГ, показало, что только фракция I супернатанта спленоцитов, прилипающих к стеклу при 32-37 ?С снижает содержание ДК, МДА, активность АЛТ, АСТ и ЩФ, но не влияет на концентрацию общего билирубина в сыворотке крыс, подвергнутых кровопусканию и не получавших инъекции СЭОМГ. Остальные фракции супернатантов, прилипающих и неприлипающих клеток, не влияли на величину показателей, характеризующих выраженность процессов ПОЛ и состояние гепатоцитов после кровопотери. На основании проведенных экспериментов можно сделать вывод, что иммуномодулирующее действие и метаболические эффекты ГАГ-Р и менадиона опосредуются цитокинами, выделяемыми различными популяциями спленоцитов.
Таблица 5
Влияние фракций клеток селезенки КПК, получавших инъекции СЭОМГ, на развитие ГИО у интактных крыс
Фракции АОК
Клетки селезенки, не прилипающие к стеклу
Супернатант 50,6±5,2*
Фракция I 23,7±2,8
Фракция II 25,0±3,1
Фракция III 56,3±6,1*
Клетки селезенки, прилипающие к стеклу при 4-10?С
Супернатант 8,6±0,9*
Фракция I 25,6±2,6
Фракция II 8,8±1,1*
Фракция III 24,2±2,8
Клетки селезенки, прилипающие к стеклу при 32-37?С
Супернатант 64,6±7,2*
Фракция I 23,8±2,9
Фракция II 25,5±2,9
Фракция III 48,5±5,1**
Фракция I III 47,8±5,2**
Фракция II III 68,3±7,4***
Примечание: 1) каждая средняя величина получены в опытах на 8-10 крысах;
2) в контроле количество АОК 24,7±3,1 тыс./орган, количество РОК 52,6±5,8 тыс./орган;
3) * - существенность различий относительно контроля;
4) ** - существенность различий относительно не фракционированного супернатанта;
5) *** - существенность различий относительно группы фракция I III.
В качестве препарата сравнения использовали гетерополисахарид животного происхождения - гиалуронат калия. Оказалось, что внутрижелудочное и внутримышечное введение ГК в дозах, соответственно равных 10 мг/кг и 5 мг/кг не оказывало влияния на ФМА лейкоцитов, развитие ГИО и ГЗТ у здоровых крыс.
Отдельное использование ГК и менадиона не оказывает влияния на ФМА ПЯЛ, показатели ГИО и ГЗТ животных после кровопотери. Совместное внутримышечное применение ГК с менадионом не влияет на ФЧ, но повышает ФИ, НСТ-сп. и НСТ-ст. тесты, развитие ГИО и ГЗТ у животных после кровопотери.
Иммунометаболические эффекты, вызываемые N-ацетилнейраминовой кислотой, глюкозамином, водо- и жирорастворимыми витаминами после кровопотери. Введение после кровопотери АНК в дозе 1 мг/кг увеличивало показатели ГИО, но не влияло на выраженность ГЗТ. В дозе 2 мг/кг АНК нормализовала развитие ГИО и усиливала, но не нормализовала развитие ГЗТ. ГА в дозе 1 мг/кг не влиял на иммунную реактивность, а в дозе 2 мг/кг - угнетал показатели ГИО и ГЗТ. N-ацетилнейраминовая кислота уменьшала выраженность вызываемого кровопотерей снижения величины метаболических маркеров активности полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов (активности НАДФН-оксидазы и содержания ФДФ) и не влияла на величины маркеров эритроцитов и тромбоцитов (активности Mg2 -АТФАЗЫ и содержания МДА). Установлено, что тромбоциты, полученные после кровопотери существенно угнетают активность Mg2 -АТФАЗЫ в стромальных частицах эритроцитов интактных животных (активность Mg2 -АТФАЗЫ стромы эритроцитов интактных крыс равнялась 0,63±0,08%, активность фермента после инкубации стромы с тромбоцитами - 0,40±0,05 мкмоль фосфата на 1г белка в час, р < 0,05). Снижают выраженность феномена АЗКЦ (до инкубации 11,6±1,3% после инкубации - 7,2±0,8%), не влияя на активность НАДФН-оксидазы ПЯЛ (до инкубации - 1,31 ± 0,19, после инкубации 13,8 ± 0,17 г · моль/мин на 103 клеток) и содержание ФДФ в лимфоцитах (до инкубации - 0,92±0,18, после инкубации 0,78±0,15 пкмоль/106 клеток). Введение АНК после кровопотери не влияло на вызываемое тромбоцитами снижение активности Mg2 -АТФАЗЫ стромы эритроцитов интактных животных и ослабляло тромбоцит-зависимое снижение индекса АЗКЦ.
Введение АНК, пиридоксина, фолата или кобаламина здоровым или КПК не оказывало влияния на ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ. Сочетанное применение АНК с пиридоксином, фолатом вызывало существенное повышение всех показателей, характеризующих ФМА ПЯЛ, выраженность развития ГИО (но не ГЗТ) на ЭБ. При сочетании АНК с кобаламином величины ФМА ПЯЛ, ГИО и ГЗТ достигали уровня контроля. Введение после кровопотери ретинола ацетата, токоферола ацетата повышало (но не нормализовали) ФМА ПЯЛ и иммунологическую реактивность организма в отношении ЭБ. Инъекции АНК не влияли на эффекты, вызываемые токоферола ацетатом, но усиливали иммуномодулирующее действие ретинола ацетата и менадиона (табл. 6).
Таблица 6
Влияние сочетанного применения N-ацетилнейраминовой кислоты, водо- и жирорастворимых на иммунную реактивность и ФМА нейтрофилов КПК
9. Кровопотеря, введение менадиона и АНК 55,87±5,6*2-5,8 28,3±3,2*2-5,8 27,9±3,2*2-5,8 5,9±0,6*2-5,8
Введение АНК и препаратов витаминов В6 В9 и В12 по отдельности не влияло на показатели окислительно-энергетического статуса и иммунологические свойства легких и тяжелых эритроцитов КПК. Введение АНК в сочетании с пиридоксином, фолатом или кобаламином уменьшало выраженность метаболических изменений эритроцитов и их иммуносупрессирующих свойств, а инъекции АНК с кобаламином, кроме указанного выше индуцировали появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов.
Экстракорпоральное воздействие АНК и кобаламина или АНК и менадиона на эритроциты не индуцировало появление у них иммуномодулирующих свойств. Это дает основание считать, что необходимой предпосылкой появления у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующей активности, служит изменение в организме метаболического состояния эритроцитов, возможно, их энергетического и антиоксидантного потенциала, сопровождающегося возникновением мембранных структур, распознаваемых иммунокомпетентными клетками крови и лимфоидных органов.
Для проверки обоснованности этого представления проведены два варианта экспериментов. В первом КПК, получавшим инъекции кобаламина или менадиона вводили экстракорпорально обработанные АНК тяжелые эритроциты интактных крыс, во втором - КПК, получавшим инъекции АНК, вводили экстракорпорально обработанные кобаламином или менадионом эритроциты здоровых крыс. В первом случае имел место иммуномодулирующий эффект, во втором такой эффект не выявлен. На основании полученных данных можно считать, что кобаламин и менадион в организме КПК сенсибилизируют эритроциты к последующему экстракорпоральному взаимодействию с АНК, приводящему к появлению у эритроцитов иммуностимулирующей активности. В отличие от этого АНК в организме не повышает чувствительности эритроцитов к экстракорпоральному взаимодействию с витаминами.
Можно предположить, что N-ацетилнейраминовая кислота взаимодействует с гликопептидными эпитопами наружной поверхности цитоплазматической мембраны эритроцита. Кобаламин внедряется в фосфолипидную структуру мембраны, а менадион проникает в цитоплазму клетки и активирует белки, регулирующие активность мембранных белков (Лазарев А.И., Конопля Н.А., 2003). Вероятно, вызываемые кобаламином и менадионом метаболические эффекты трансформируются в конформационные изменения эпитопов, облегчающие связывание с ними N-ацетилнейраминовой кислоты. Результатом этого, по-видимому, является повышение эффективности взаимодействия эритроцитов с мембранными структурами макрофагов, приводящее к активации их защитных функций.
В качестве препарата сравнения выбран глюкозамин. Введение глюкозамина здоровым или подвергнутым кровопусканию крысам не оказывало влияния на ФМА ПЯЛ и развитие ГИО, индуцированного ЭБ. Инъекции глюкозамина с витаминами усиливали иммунологические функции после острой кровопотери. Наиболее выраженным было иммуномодулирующее действие глюкозамина с кобаламином, однако, даже в случае введения этих препаратов, параметры иммунологических функций не нормализовались полностью.
Иммуномодулирующее действие гиалуронидазы и жирорастворимых витаминов в норме и после кровопотери. Введение здоровым животным препарата гиалуроновой кислоты вызывает слабо выраженный иммуносупрессирующий эффект. В отличие от этого, продукты частичного гидролиза гликозаминогликанов стимулируют индуцированную фитогемагглютинином бласттрансформацию лимфоцитов и выделение ими хелперных цитокинов, усиливают развитие гуморальной и клеточной форм иммунного ответа (Лазарев А.И., Прокопенко Л.Г., 1995). Фрагментация гликозаминогликанов осуществляется набором ферментов, важнейшим из которых является гиалуронидаза. Установлено, что введение гиалуронидазы повышало ФМА полинуклеаров, стимулировало развитие ГИО и ГЗТ в норме и не влияло на указанные параметры после кровопотери. Изучение влияния гиалуронидазы на иммуномодулирующее действие жирорастворимых витаминов показало, что введение гиалуронидазы с РА, ТА или менадионом приводило к выраженному повышению фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов и иммунологической реактивности у здоровых крыс. Инъекции гиалуронидазы или жирорастворимых витаминов по отдельности не приводили к появлению в крови животных эритроцитов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Введение гиалуронидазы с РА или менадионом индуцировало появление у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующих свойств. Инъекции гиалуронидазы с ТА такого эффекта не вызывали (табл. 7).
Таблица 7
Влияние гиалуронидазы и жирорастворимых витаминов на ФМА лейкоцитов, развитие ГИО и ГЗТ у здоровых крыс
Показатели 1 2 3 4 5
Контроль Кровопотеря Введение Г и РА Введение Г и ТА Введение Г и менадиона
Установлено, что введение интактным крысам ЭКПГ не влияло на активность полинуклеаров и выраженность иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Инъекции ЭКПГ животным, получавшим РА, ТА или менадион, повышали активность полинуклеаров и стимулировали развитие иммунного ответа в значительно большей степени, чем введение этих препаратов без ЭКПГ. Наиболее выраженное усиление ГИО и ГЗТ имело место при введении ЭКПГ крысам, которым вводили менадион.
Иммунометаболические эффекты, вызываемые лизоцимом при кровопотере. Введение после кровопотери лизоцима дозозависимо снижало содержание ДК и МДА, активность АЛТ и ACT, нормализовало содержание лизоцима сыворотки крови при введении лизоцима в дозе 5 мг/кг. Введение лизоцима в дозе 1 мг/кг усиливало, а в дозе 5 мг/кг нормализовало развитие иммунного ответа на ЭБ. Обе дозы препарата индуцировали появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов КПК. Введение интактным крысам супернатанта спленоцитов, содержащего иммуносупрессирующий фактор, не оказывало влияния на содержание продуктов ПОЛ и активность ферментов в сыворотке крови. В отличие от этого, введение после кровопотери супернатанта спленоцитов, содержащего хелперный фактор, снижало величины показателей, характеризующих выраженность ПОЛ и проницаемость мембран гепатоцитов. Таким образом, антиоксидантное действие лизоцима после кровопотери опосредуется факторами, выделяющимися клетками селезенки. Вероятно, эти факторы являются элементами механизма, обеспечивающего сохранение структурного гомеостаза при острой потере значительного количества крови.
В связи с изложенным, интересно было выяснить, вызывает ли иммуностимулирующий и мембранопротекторный эффекты один и тот же фактор или их возникновение обусловлено разными соединениями. Установлено, что фракция I супернатантов прилипающих при температуре 32-37°С спленоцитов, выделенных после кровопотери, при введении КПК крысам, не получавшим лизоцим, вызывала снижение содержания ДК и МДА, активность АЛТ и ACT, а также усиливала иммунный ответ на ЭБ, фракция II была неактивной, а фракция III стимулировала иммунную реакцию на ЭБ, но не влияла на содержание продуктов ПОЛ и активность ферментов в крови реципиента (рис. 1).
Рис. 1 Активность супернатантов клеток селезенки крыс после кровопотери и введения лизоцима
Введение ВФСС существенно повышало активность СОД и ГР, а инъекции НФСС не влияли на биохимические показатели эритроцитов. Таким образом, в составе ВФСС, полученных после кровопотери и введения лизоцима, содержится фактор, активирующий синтез антиоксидантных ферментов и ограничивающий выраженность ПОЛ клеточных мембран. Эритроциты, полученные после кровопотери и инъекций высокомолекулярной фракции, не обладали иммуносупрессирующими свойствами, а эритроциты животных, которым вводили низкомолекулярную фракцию, при аллогенном переносе супрессировали развитие иммунного ответа на ЭБ.
Отсутствие иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов, полученных у КПК и введения лизоцима, может быть объяснено блокирующим влиянием ВФСС на выделение в сосудистое русло или образованием в нем соединений, индуцирующих появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов или индуцирующим влиянием ВФСС на выход в сосудистое русло эритроцитов, резистентных к действию сывороточных субстанций, накапливающихся после кровопотери.
Результаты проведенных экспериментов позволяют считать, что иммуномодулирующее действие лизоцима при кровопотере обусловлено модификацией эритроцитов и выделением под влиянием модифицированных эритроцитов хелперных цитокинов прилипающими к стеклу клетками селезенки. Наряду с этим, лизоцим опосредованно, через цитокины спленоцитов, вызывает изменение антиоксидантного статуса эритроцитов.
Кровопотеря снижала скорость реакции окисления НАДФН в ПЯЛ крови. Введение после кровопотери увеличивало скорость и НАДФН-оксидазной реакции в ПЯЛ.
Принимая во внимание данные об участии цитокинов прилипающих к стеклу клеток селезенки в реализации модулирующего влияния лизоцима на ФМА лейкоцитов, большой интерес представлял вопрос: обусловлено ли повышение скорости реакции, катализируемой НАДФН-оксидазой, при введении лизоцима, влиянием на фермент лизоцима, или этот эффект вызывают выделяющиеся под влиянием лизоцима прилипающих к стеклу клеток? Для решения этого вопроса ПЯЛ, полученные после кровопотери, экстракорпорально примировали лизоцимом или фракциями супернатантов прилипающих и неприлипающих клеток селезенки.
Установлено, что примирование лизоцимом не влияло на скорость реакции, катализируемой НАДФН-оксидазы. В отличие от этого, низкомолекулярная фракция супернатантов прилипающих к стеклу при 32-37 ?С спленоцитов, полученных у КПК, получавших инъекции лизоцима, или тяжелых эритроцитов крыс, которым вводили лизоцим, увеличивала скорость НАДФН-оксидазной реакции ПЯЛ КПК. На основании полученных данных можно прийти к заключению о том, что активатором НАДФН-оксидазы ПЯЛ КПК является не лизоцим, а выделяющиеся под его влиянием цитокины клеток, прилипающих к стеклу при 32-37 °С.
Взаимосвязь иммуномодулирующих эффектов, вызываемых лизоцимом и жирорастворимыми витаминами после кровопотери. Лизоцим, филлохинон и менадион, введенные по отдельности, не влияли на показатели ФМА ПЯЛ и иммунологической реактивности. Лизоцим, введенный с филлохиноном или менадионом, повышал, но не нормализовал, ФМА нейтрофилов и иммунологическую реактивность КПК. Кровопотеря приводила к появлению в крови легких эритроцитов, обладающих иммуносупрессорной активностью. Инъекции лизоцима, филлохинона или менадиона по отдельности не влияли на свойства эритроцитов крыс, подвергнутых кровопусканию. Введение КПК лизоцима с филлохиноном или менадионом не отменяло иммуносупрессирующих свойств легких эритроцитов, но индуцировало появление иммуностимулирующей активности у тяжелых клеток.
При изучении концентрации АСТ, АЛТ, ЩФ и ОБ после кровопотери выявлено повышение исследованных показателей. Введение КПК лизоцима и лизоцима в сочетании с токоферола ацетатом не влияло, а в сочетании с ретинола ацетатом или менадионом нормализовало уровень АСТ, АЛТ, ЩФ и ОБ (табл. 8).
Таблица 8
Метаболические эффекты лизоцима и жирорастворимых витаминов у КПК
Условия опыта 1. 2 3 4 5 6
Контроль КПК КПК, введение лизоцима КПК, введение лизоцима и РА КПК, введение лизоцима и ТА КПК, введение лизоцима и менадиона
Исследована иммуномодулирующая активность стромы эритроцитов интактных крыс, включавших менадион и затем обработанных лизоцимом. Оказалось, что введение СВМОЛ животным, иммунизированным ЭБ, повышало ФМА мононуклеаров, стимулировало развитие ГИО и ГЗТ в большей степени, чем строма, включившая менадион, но не обработанная ферментом.
Результаты этих экспериментов дают основание считать, что менадион вызывает иммуностимулирующий эффект, проникая во внутрь фагоцитировавшей стромальную частицу клетки, в то время как действие лизоцима реализуется на уровне мембраны эритроцита, в которой эти соединения модифицируют структуру фосфолипидной матрицы и интегрированных в нее гликопротеидных молекул.
Принципиально важно было выяснить иммуномодулирующую эффективность сочетанного применения лизоцима и нафтохинонов, а также СВМОЛ в условиях вторичного иммунодефицитного состояния, вызванного кровопотерей 2 % от массы тела. Оказалось, что введение лизоцима и менадиона повышало, но не нормализовало, ФМА нейтрофилов и иммунологическую реактивность КПК. В отличие от этого, инъекции КПК СВМОЛ нормализовали ФМА ПЯЛ периферической крови, а также развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ (табл. 9).
Таблица 9
Влияние СВМОЛ на ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и ГЗТ у КПК
Показатели Контроль КПК КПК, введение лизоцима и менадиона КПК, инъекции СВМОЛ
Полученные данные дают основание считать, что иммуномодулирующая активность СВМОЛ при кровопотере опосредуется цитокинами, выделяющимися макрофагальными клетками селезенки.
Иммуномодулирующее действие лизоцима и водорастворимых витаминов при кровопотере. Крысам после кровопотери по указанной выше схеме вводили лизоцим и препараты витаминов по отдельности или в парных сочетаниях. В день последнего поступления препаратов животных иммунизировали ЭБ. Установлено, что введение лизоцима с пиридоксином или фолатом не влияло на величины показателей, характеризующих ФМА ПЯЛ и иммунологическую реактивность. Выраженный иммуномодулирующий эффект наблюдался при введении лизоцима с кобаламином (табл. 10).
При введении КПК, получавшим инъекции лизоцима супернатантов спленоцитов, прилипающих при температуре 4-10?С, установлено иммуносупрессирующее влияние на развитие ГИО, индуцированного ЭБ. Фракционирование супернатантов показало, что иммуносупрессирующей активностью обладала фракция с молекулярной массой 50-60 КД.
Введение супернатантов, прилипающих при температуре 32-37 ?С вызывало иммуностимулирующие эффекты на ГИО КПК после введения лизоцима. Фракционирование показало, что иммуностимулирующие эффекты присущи фракции с молекулярной массой 10-15 КД, а гепатопротекторные - фракции с массой >100 КД. Также иммуностимулирующие эффекты установлены у фракции неприлипающих клеток с молекулярной массой 10-15 КД.
Таблица 10
Метаболические эффекты лизоцима и водорастворимых витаминов у КПК
Условия опыта 1. 2 3. 4 5 6
Контроль КПК КПК, введение лизоцима КПК, введение лизоцима и пиридоксина КПК, введение лизоцима и фолата КПК, введение лизоцима и кобаламина
Введение лизоцима с пиридоксином или фолатом не приводило к появлению в крови здоровых животных эритроцитов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. В отличие от этого, лизоцим в сочетании с кобаламином обусловливали возникновение у тяжелых эритроцитов хелперной активности. Установлено, что введение ЭКПЛ животным, получавшим пиридоксин или кобаламин, повышало ФМА нейтрофилов, стимулировало развитие ГИО и ГЗТ в значительно большей степени, чем введение этих препаратов без ЭКПЛ. Введение ЭКПЛ крысам, получавшим фолат, не оказывало влияния на активность полинуклеаров и развитие иммунного ответа. Таким образом, лизоцим индуцировал появление хелперных свойств у эритроцитов только при введении с кобаламином (но не с пиридоксином или фолатом). Вместе с тем, ЭКПЛ повышали ФМА ПЯЛ и стимулировали развитие различных форм иммунного ответа при введении животным, получавшим пиридоксин или кобаламин (но не фолат).
Принципиально важно было выяснить, обладают ли иммуномодулирующими свойствами эритроциты крыс, получавших лизоцим и препараты витаминов при кровопотере. Проведенные для решения этого вопроса эксперименты показали, что тяжелые эритроциты, полученные после кровопотери и введения лизоцима, приобретают выраженные иммуностимулирующие свойства. Инъекции таких эритроцитов КПК повышали функционально-метаболическую активность полинуклеаров периферической крови и усиливали или нормализовали развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ.
Результаты проведенных исследований позволяют прийти к выводу о существенной роли тяжелых эритроцитов в реализации взаимосвязанного иммуномодулирующего действия лизоцима, пиридоксина и кобаламина. Они показывают, что введение лизоцима с кобаламином является эффективным средством иммуномодуляции при кровопотере в эксперименте и обусловливают целесообразность клинической апробации эффективности такого сочетания.
Иммунометаболические эффекты протеолитических ферментов и жирорастворимых витаминов при острой кровопотере. Протеолитические ферменты оказывают выраженное влияние на процессы фагоцитоза, являющиеся у высших организмов основной формой защиты от патогенных микробов и составной частью многих физиологических и патологических реакций. Они изменяют структуру рецепторного аппарата лимфоцитов периферической крови и лимфоидных органов и вызывают глубокие изменения клеточного метаболизма (Прокопенко Л.Г. и др., 1994). Острая кровопотеря приводит к нарушению баланса протеолитического и антипротеолитического потенциала крови. Равновесие между этими параметрами сдвигается в сторону преобладания активности антипротеолитических белков, что может стать причиной ослабления регулирующего влияния протеаз на гомеостаз и угнетения функциональной активности клеток крови, участвующих в развитии иммунологических процессов - нейтрофилов, лимфоцитов, эритроцитов и тромбоцитов (Прокопенко Л.Г. и др., 2003).
Изучение иммунометаболических эффектов, вызываемых протеолитическими ферментами и их сочетанием с жирорастворимыми витаминами при острой кровопотере показало, что введение папаина здоровым животным снижает ФМА нейтрофилов, угнетает развитие различных форм иммунного ответа, тогда как террилитин вызывает противоположные эффекты. Инъекции папаина после кровопотери не влияют на показатели иммунологических функций, а террилитин уменьшает выраженность их супрессии. Совместное введение террилитина и ретинола ацетата эффективно корригирует иммунологические функции здоровых животных, инъекции террилитина с менадионом - у животных подвергнутых кровопусканию. Иммуномодулирующие эффекты совместного применения террилитина и жирорастворимых витаминов в норме и при кровопотере опосредуются эритроцитами.
Эритроциты интактных крыс, экстракорпорально обработанные лизоцимом или террилитином при аллогенном переносе повышали ФМА нейтрофилов и стимулировали развитие различных форм иммунного ответа в норме и при острой кровопотере. Лейкоциты интактных крыс, обработанные террилитином, приобретали иммуностимулирующие свойства, а инкубированные с лизоцимом, были лишены иммунологической активности. Наиболее выраженный иммуностимулирующий эффект после острой кровопотери вызывают лейкоциты, обработанные террилитином, наименее выраженный - эритроциты, обработанные этим ферментом. Инкубация с лизоцимом или террилитином эритроцитов, полученных после кровопотери, индуцировала появление у них имумностимулирующих свойств, лейкоциты, обработанные террилитином или лизоцимом были лишены иммуномодулирующей активности.
Эритроциты, экстракорпорально обработанные лизоцимом и лейкоциты, инкубированные с террилитином приобретали свойство индуцировать выделение прилипающими к стеклу клетками селезенки факторов, стимулирующих развитие иммунного ответа, повышающих активность антиоксидантных ферментов и снижающих содержание продуктов перекисного окисления липидов в печени после кровопотери.
Экстракорпоральное воздействие менадиона повышало выраженность иммуномодулирующих свойств после инкубации эритроцитов крыс, подвергнутых кровопусканию, с лизоцимом, но не индуцировало иммуномодулирующей активности после инкубации с террилитином. Кобаламин после кровопотери не влиял на свойства эритроцитов, обработанных лизоцимом или террилитином (рис. 2)
Рис. 2 Влияние менадиона и кобаламина на эффект появления иммуномодулирующих свойств, вызываемых лизоцимом и террилитином у эритроцитов и лейкоцитов, полученных после кровопотери.
1. Лазарева, Г.А. Иммуномодулирующее действие фитопрепаратов при острых кровопотерях / Г.А. Лазарева, В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина / Метаболическая иммуномодуляция / под ред. Л.Г. Прокопенко, А.И. Конопли. - Курск, 2000. - С. 199-209.
2. Прокопенко, Л.Г. Иммунометаболические эффекты, вызываемые дозозависимым кровопусканием и их коррекция стабилизаторами клеточных мембран / Л.Г. Прокопенко, Г.А. Лазарева, В.Н. Рыбников / Метаболическая иммуномодуляция / под ред. Л.Г. Прокопенко, А.И. Конопли. - Курск, 2000. - С. 180-187.
3. Рыбников, В.Н. N-ацетилнейраминовая кислота как иммуномодулятор при кровопотерях / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Человек и его здоровье. - Курск, 2000. - Вып. 3. - С. 198-200.
4. Рыбников, В.Н. Влияние жирорастворимых витаминов на антиоксидантный и энергетический статус эритроцитов при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Материалы IV съезда иммунологов и аллергологов СНГ «Аллергология и иммунология». - М., 2000. - Т.2, №2. - С.137.
5. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие витамина К при острых кровопотерях / В.Н. Рыбников, А.А. Конопля // Тез докл. VII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2000. - С. 541.
6. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие нафтохинонов при острых кровопотерях / В.Н. Рыбников, А.А. Конопля, И.Л. Бровкина / Метаболическая иммуномодуляция / под ред. Л.Г. Прокопенко, А.И. Конопли. - Курск, 2000. - С. 194-199.
7. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие полисахаридов и N-ацетилнейраминовой кислоты при острых кровопотерях / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Материалы IV съезда иммунологов и аллергологов СНГ «Аллергология и иммунология». - М., 2000. - Т.2, №2. - С.136.
8. Рыбников, В.Н. Нафтохиноны как иммуномодуляторы при острых кровопотерях / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Сб. науч. тр., посвящ. 65-летию КГМУ «Актуальные проблемы медицинской науки и фармации». - Курск, 2000. - С.72-73.
9. Бровкина, И.Л. Иммуномодулирующее действие гетерополисахаридов и N-ацетилнейраминовой кислоты при острых кровопотерях / И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Сб. науч. тр. «Актуальные проблемы медицины и фармации». - Курск, 2001. - С.42.
10. Рыбников, В.Н. Влияние жирорастворимых витаминов на антиоксидантный и энергетический статус эритроцитов при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Сб. науч. тр. «Актуальные проблемы медицины и фармации». - Курск, 2001. - С.290-291.
11. Бровкина, И.Л. Иммуномодулирующее действие гиалуронидазы и жирорастворимых витаминов в норме и при острой кровопотере / И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С.8-11.
12. Бровкина, И.Л. Иммуномодулирующее действие гликолитических ферментов при токсических формах анемии и кровопотере / И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Курский науч-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С.3-7.
13. Бровкина, И.Л. Иммуномодулирующее действие пиридоксина, фолата, кобаламина и гликозаминогликанов при кровопотере / И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Курский науч-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С.12-19.
14. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие гликозаминогликанов и жирорастворимых витаминов при острых кровопотерях / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Курский науч-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С.81-86.
15. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие эритроцитов и их стромы, инкубированных с гликозаминогликанами Polygonaceae и менадионом, при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Курский науч-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С.87-92.
16. Рыбников, В.Н. Функционально-метаболическая активность лейкоцитов и ее коррекция лизоцимом при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Курский науч-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С.93-97.
17. Бровкина, И.Л. Пиридоксин, фолат и кобаламин как иммуномодуляторы при различных формах анемии / И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Тез. докл. X Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - (7-11 апреля 2003 г., г. Москва). - М., 2003. - С.698.
18. Рыбников, В.Н. Взаимосвязь иммуномодулирующих эффектов, вызываемых лизоцимом и нафтохинонами, при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - Т.48, №5. - С.7-10.
19. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие растительных гетерополисахаридов и жирорастворимых витаминов при острых кровопотерях / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Материалы междунар. науч.-практ. конф. «Современные технологии фитонутрициологии в акушерстве, гинекологии и педиатрии». - (29-30 мая 2003 г., г. Москва). - М.: Изд-во РУДН, 2003. - С.330-337.
20. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие эритроцитов и их стромы, инкубированных с менадионом и гетерополисахаридами Polygonaceae, при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина, М.Г. Газазян // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - Т.48, №4. - С.14-18.
21. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующие эффекты, вызываемые лизоцимом при острых кровопотерях / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Тез. докл. X Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - (7-11 апреля 2003 г., г. Москва). - М., 2003. - С.654.
26. Лазарева, Г.А. Иммунометаболические эффекты полисахаридов различного видового происхождения / Г.А. Лазарева, И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Иммунометаболические эффекты регуляторов энергетического обмена при нарушении гомеостаза / под ред. Л.Г. Прокопенко. - Курск, 2006. - С. 245-273.
27. Рыбников, В.Н. Иммунометаболические эффекты, вызываемые N-ацетилнейраминовой кислотой, водо- и жирорастворимыми витаминами при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. - 2007. - Т.6, №3. - С.634-637.
28. Бровкина, И.Л. Экстракорпоральное иммуномодулирующее действие гидролитических ферментов и витаминов / И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко, В.Н. Рыбников // Вестн. новых мед. технологий. - 2008. - Т.XV, №2. - С.19-21.
29. Влияние гидролитических ферментов и витаминов на иммуномодулирующие свойства эритроцитов и лейкоцитов при острой кровопотере / Рыбников, И.Л. Бровкина, А.И. Лазарев, Л.Г. Прокопенко // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т.9, №3. - С.317-318.
30. Влияние окислительно модифицированных липопротеинов на иммуносупрессирующие свойства тромбоцитов и эритроцитов при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина, А.И. Лазарев, Л.Г. Прокопенко // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т.9, №3. - С.318.
31. Имунометаболические эффекты протеолитических ферментов и жирорастворимых витаминов при острой кровопотере / А.И. Лазарев, И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников, Л.Г. Прокопенко // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2008. - №1. - С.41-47.
32. Эритроцитзависимые эффекты лекарственных и физиотерапевтических средств / А.И. Лазарев, И.Л. Бровкина, В.П. Гаврилюк, и др. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2008. - 336 с.