Общая характеристика принципа иммуноферментного анализа, его практического применения и классификации. Важнейшие особенности иммунохимического метода, основанного на использовании предварительного абсорбирования антител для иммобилизации антигена.
Аннотация к работе
Во всех областях современной медицины используется иммунный анализ, преимущественно, с диагностической и аналитической целями. Особенно важно, что они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты иммунной системы, антигены и т.д.) в низких и очень низких концентрациях. Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие).ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы. Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от не прореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных. В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. Для гетерогенных методов характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы - носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы - в растворе).Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами: · высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками; Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Ферменты и их субстраты, наиболее широко используемые в ИФА. При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно.На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием. В лунках панелей адсорбируют антигены или антитела (исследуемый материал). Часто в прямом ИФА антиген, иммобилизованный на твердой фазе, это клетки и другие корпускулярные антигены. Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата.ИФА нашел широкое применение в различных областях медицины и биологии благодаря относительной простоте и высокой чувствительности метода. ИФА успешно применяется для: • массовой диагностики инфекционных заболеваний (выявление различных специфических антигенов или антител к ним); • выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических образцах; ИФА пришел на смену широко используемым ранее в клинической практике методам агглютинации, преципитации и РИА. Чувствительность метода (под чувствительностью подразумевают минимальное выявляемое количество антител или антигена) определяется следующими факторами: аффинностью антител, предпочтительнее использование моноклональных антител; специфической активностью фермента; интенсивностью сигнала; чувствительностью учета сигнала.
План
Оглавление
Введение
1. Общие характеристики и принцип иммуноферментного анализа
2. Классификация ИФА
3. Характеристика компонентов, используемых в ИФА
4. Варианты постановки ИФА
5. Практическое применение ИФА
Список использованной литературы
Введение
Методы иммунного анализа широко вошли в медицинскую практику. Во всех областях современной медицины используется иммунный анализ, преимущественно, с диагностической и аналитической целями. Особенно важно, что они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты иммунной системы, антигены и т.д.) в низких и очень низких концентрациях. Все продукты, против которых возможно получение антител, выявляются этими методами.
Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Оценка реакции проводится автоматически, что позволяет стандартизировать эти методы.
В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста, иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и другие. При постановке реакций в один или несколько этапов они обозначаются как прямые или непрямые. Имеет значение среда, в которой проводится реакция. Если реакция проводится с реагентами, фиксированными на поверхности.
Список литературы
1. Галактионов В.Г. Иммунология. Издательство Московского университета, 1998 г.
2. Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. Медицинское информационное агентство, 2009 г.
3. Кондратьева И.А. Практикум по иммунологии. Учебное пособие для ВУЗОВ. Академия, 2004 г.
4. Лефковитс И., Пернис Б. Иммунологические методы исследования. Мир, 1988 г.
5. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. Мир, 2000 г.
6. Соколов Е.И. Клиническая иммунология. Медицина, 1998 г.
7. Фримель Г. Иммунологические методы. Медицина, 1987 г.
8. Хаитов Р. М. Иммунология. Медицина, 2000 г.
9. Шигина Ю.В. Иммунология:Учебное пособие. Издательство РИОР, 2007 г.
10. Ярилин А.А. Основы иммунологии. Медицина, 1999 г.