Гетерогенность и функциональная пластичность макрофагов второго типа активации - Автореферат

Основными клетками врожденного иммунитета являются макрофаги, развивающиеся из моноцитов периферической крови и имеющиеся во всех органах и тканях. В здоровом организме макрофаги отвечают за поддержание гомеостаза ткани, а так же за своевременный ответ на вторжение патогена, повреждение или появление трансформированных клеток. Нарушение функций макрофагов приводит к развитию хронических воспалений, аутоиммунных заболеваний, а также к инициации и прогрессии опухолей. Проводимые исследования опухоль ассоциированных макрофагов выявили их схожесть с макрофагами второго типа активации, обладающими противовоспалительными и иммуносупрессорными свойствами. Показана способность различных популяций макрофагов отвечать на бактериальные стимулы (LPS и MDP), Th1 цитокин IFN, Th2 цитокин IL-4 и дексаметазон.

Диссертация обобщает данные 17 основных статей.

Результаты и их обсуждение

Маркеры макрофагов второго типа активации

Несмотря на сформировавшуюся концепцию дихотомии макрофагальной активации, длительное время количество молекулярных особенностей, характеризующих макрофаги второго типа, было ограниченным. Поэтому, с целью обнаружения новых маркеров и более полного понимания функциональных особенностей макрофагов второго типа, были применены несколько экспериментальных подходов. Эти подходы включали получение антител специфично реагирующих с макрофагами второго типа и последующий анализ антигенов, субтрактивную гибридизацию, анализ функциональных групп генов, выбранных на основании литературных данных, и использование биочипов.

Клонирование человеческого и мышиного стабилина-1

На начальном этапе целью работы было исследование функции одного из маркеров макрофагов второго типа - антигена MS-1, позднее получившего название стабилин-1. Для клонирования и дальнейшего анализа, антиген MS-1 был выделен из первичных человеческих макрофагов и проанализирован при помощи методики MALDI-TOF, что позволило определить фрагмента 3-ей хромосомы, потенциально содержащий ген, кодирующий антиген MS-1. При помощи компьютерного анализа полученного геномного фрагмента была определена его экзон-интронная структура, что позволило амплифицировать и клонировать большую часть кодирующей последовательности. Для клонирования 5’-конца МРНК, была использована методика 5’-RACE. Окончательный вариант последовательности человеческого стабилина-1 был помещен в базу данных EMBL под номером AJ275213. Для клонирования полноразмерного мышиного стабилина-1 использовалась та же стратегия, что и для клонирования человеческого гена. Полученная последовательность была помещена в базу данных EMBL под номером AF290914. Сравнение последовательностей мышиного (линия BALB/c) и человеческого стабилина-1 показало, что на уровне МРНК гены идентичны на 83%. Белки, в свою очередь, были идентичны на 82%.

Анализ экспрессии стабилина в различных тканях

Экспрессию МРНК стабилина-1 в различных клетках исследовали при помощи Норзерн блот гибридизации, используя РНК, выделенную из первичных человеческих макрофагов, эндотелиальных клеток и различных клеточных линий. Кроме того, для анализа экспрессии МРНК стабилина-1 в различных тканях использовали готовые мембраны производства фирмы Clontech, содержащие образцы РНК, выделенной из различных тканей человека - так называемые MTN (multiple tissue Northern). Экспрессия стабилина-1 обнаруживалась преимущественно в макрофагах второго типа (М2), стимулированных IL-4, дексаметазоном или их комбинацией(Рис. 1).

Рисунок 1. Анализ экспрессии стабилина-1. A. Анализ экспрессии МРНК стабилина-1 в различных тканях при помощи Норзерн блот гибридизации. Дорожки с 1 по 14 содержат образцы МРНК выделенной из сердца (1), мозга (2), тимуса (3), плаценты (4), легких, печени (5), скелетных мышц (6), почек (7), поджелудочной железы (8), селезенки (9), лимфатических узлов (10), тимуса (11), лейкоцитов периферической крови (12), костного мозга (13), фетальной печени (14). Банды соответствующие стабилину-1 и -актину указаны стрелками. B. Анализ экспрессии МРНК стабилина-1 в первичных человеческих макрофагах при помощи Норзерн блот гибридизации. На дорожки с 1 по 5 нанесена РНК, выделенная из макрофагов на 3 день культивирования, на дорожки с 6 по 10 нанесена РНК, выделенная из макрофагов на 6 день культивирования. Дорожки 1 и 6 - нестимулированные макрофаги, дорожки 2 и 7 - макрофаги, стимулированные IFN-гамма, дорожки 3 и 8 - макрофаги, стимулированные IL-4, дорожки 4 и 9 - макрофаги, стимулированные дексаметазоном, дорожки 5 и 10 - макрофаги, стимулированные IL-4 и дексаметазоном. C. Анализ экспрессии стабилина-1 в клеточных линиях при помощи Норзерн блот. Дорожки с 1 по 6 содержат образцы РНК, выделенной из клеток Huvec, Huvec 926, Huaec, HEPG2, HL 60, CDC соответственно. Дорожки с 7 по 9 содержат РНК, выделенную из макрофагов на 3-й день культивирования. Дорожка 7 - нестимулированные макрофаги, дорожка 8 - IFN-гамма стимулированные макрофаги, IL-4 и дексаметазон стимулированные макрофаги - дорожка 9.

Анализ экспрессии МРНК стабилина-1 в различных органах показал, что стабилин-1 экспрессируется в плаценте (содержащей большое количество макрофагов второго типа), поджелудочной железе, печени и лимфатических узлах (Рис. 1А). Анализ клеточных линий показал, что большинство проанализированных клеточных линий стабилин-1 не экспрессируют (Рис. 1C).

Анализ структуры белка стабилина-1

Анализ аминокислотной последовательности человеческого стабилина-1 позволил определить, что теоретический молекулярный вес белка равен 275 КДА. Предсказанный молекулярный вес соответствовал наблюдавшемуся ранее в Вестерн блот анализе белку размером около 280 КДА (Goerdt et al, 1991) а так же рекомбинантному стабилину-1.

Анализ вторичной структуры белка при помощи программы PREDATOR показал, что стабилин-1 содержит несколько -спиралей и -листов. Поиск доменов при помощи баз данных PROSITE и Pfam выявил наличие 3 тандемов фасциклиновых доменов и одного одиночного фасциклинового домена на С-конце белка. Кроме того были обнаружены 16 EGF-подобных доменов и 3 ламининовых EGF-подобных домена (Рис. 2). На С-конце белка был обнаружен X-линк домен, характерный для гиалурон-связывающих белков. Поиск других доменов, участвующих в связывании гиалурона, выявил 3 B(X7)B домена. Анализ гидрофобности стабилина-1 позволил предсказать наличие сигнального пептида, состоящего из 25 аминокислот на N-конце белка. Трансмембранный домен находился непосредственно за последним фасциклиновым доменом (Рис. 2). Анализ последовательности стабилина-1 при помощи программы для поиска сигналов определяющих внутриклеточную локализацию белка - PSORT позволил предположить, что стабилин-1 курсирует между плазматической мембраной и эндосомальным компартиментом.

Исходя из доменной структуры белка и участия в эндоцитозе в эндотелиальных клетках печени, стабилин-1 был классифицирован как скавенджер рецептор (Hansen et al, 2005; Horiuchi et al, 2003).

Рисунок 2. Структура человеческого стабилина-1

Стабилин-1 отвечает за эндоцитоз ACLDL в стабильно трансфецированных клетках CHO

Для исследования эндоцитозной активности стабилина-1 был использован ACLDL, являющийся, по сообщению Прево и коллег, лигандом стабинина-1. (Prevo et al, 2004). Эффективность эндоцитоза определяли при помощи проточной цитометрии. После 30 мин инкубации в присутствии ACLDL-Alexa488, в клетках, трансфецированных стабилином-1, наблюдалось 10-и кратное по сравнению с клетками, трансфецированными пустым вектором, количество ACLDL (Рис. 3). Эти данные прямо указывают на участие стабилина-1 в эндоцитозе ACLDL.

Рисунок 3. Анализ стабилин-1-зависимого эндоцитоза в клетках СНО-К1 при помощи проточной цитометрии. Незаштрихованные гистограммы: клетки без добавления лиганда, заштрихованные гистограммы: клетки были проинкубированы с лигандом в течение 30 мин при 37°C. (A) Эндоцитоз ACLDL-Alexa488, (B) эндоцитоз трансферрина-Alexa546. Эксперименты были повторены не менее 5 раз с похожими результатами.

Исследование эндоцитоза при помощи иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии показало, что уже через 5 минут инкубации с лигандом, стабилин-1 перемещался в маленькие везикулы, содержащие ACLDL, которые распределялись по периферии клетки. При этом только часть стабилина-1 сохранялась в центральных областях клетки в ранних эндосомах. В течение первых 30 мин инкубации с лигандом стабилин-1 доставлял ACLDL в EEA1-позитивные ранние эндосомы (Рис. 4). По истечении 30 минут часть ACLDL оказывалась в EEA1-негативных поздних эндосомах, в которых находилось значительно меньше стабилина-1, чем в ранних эндосомах. Через час большая часть ACLDL концентрировалась в поздних эндосомах, которые также содержали некоторое количество стабилин-1.

Рисунок 4. Стабилин-1 отвечает за транспорт ACLDL в стабильно трансфецированных клетках CHO-K1. Клетки непрерывно инкубировали с лигандом в течение 5, 15 и 30 мин; в случае 1 часа, клетки инкубировали с лигандом в течение 20 мин, отмывали и продолжали инкубация 40 мин в среде не содержащей ACLDL. ACLDL-Alexa488 показан зеленым, стабилин-1 - красным, EEA1 - синим. Желтые участи показывают участки колокализации красного и зеленого. Розовые - колокализации красного и синего, голубые - колокализации зеленого и синего. Белые участки - результат колокализации всех трех цветов. (A) Транспорт ACLDL в клетках CHO-stabilin-1. Выделяются многочисленные EEA1-негативные, но ACLDL/стабилин-1 позитивные поздние эндосомы, распределенные в цитоплазме по периферии клетки в 1 часовом эксперименте. (B) Незначительное количество ACLDL ассоциировано с клетками CHO-vector. Эксперимент был повторен 3 раза с похожим результатом.

Эти везикулы располагались на периферии клеток, в отличие от ранних эндосом, которые оставались в перинуклеарной области (Рис. 4). В контрольных клетках наблюдалось лишь незначительное количество ACLDL связанного с поверхностью клеток.

На основании полученных данных можно заключить, что стабилин-1 отвечает за специфический эндоцитоз ACLDL, а так же за его транспорт по эндосомальному пути.

Вортманнин вызывает накопление ACLDL в ранних эндосомах

Для дальнейшего исследования механизма эндоцитоза с участием стабилина-1, было исследовано участие фосфоинозитол-3 киназы (PI3K) в эндоцитозе ACLDL в клетках CHO. Обработка клеток ингибитором PI3K вортманнином приводила к изменению формы EEA1 позитивных ранних эндосом даже в отсутствии лиганда для эндоцитоза через стабилин-1. Уже через 15 мин обработки вортманнином, наряду с эндосомами нормальной морфологии, в клетках обнаруживались увеличенные слившиеся эндосомы. Этот эффект усиливался после 30 мин и 1 часа обработки.

Для того чтобы определить какой именно этап транспорта, регулируемого стабилином-1, зависит от PI3K, клетки обрабатывали вортманнином за 30 минут до добавления в среду ACLDL. Было обнаружено, что связывание и эндоцитоз ACLDL не зависят от обработки клеток вортманнином. Через 30 мин после начала эндоцитоза, ACLDL аккумулировался в EEA1-позитивных эндосомах, которые так же содержали стабилин-1. Этот же эффект наблюдался и в необработанных клетках. Однако, в клетках, обработанных вортманнином, стабилин-1-положительные эндосомы, содержащие ACLDL, были увеличены и имели неправильную форму. Некоторые из этих структур не содержали EEA1 или содержали очень незначительное его количество по сравнению с необработанными клетками. Наибольший эффект вортманнина наблюдался через час после начал эндоцитоза. Перенос ACLDL и стабилина-1 в поздние эндосомы был практически полностью блокирован. И стабилин-1 и ACLDL оставались в EEA1 положительных эндосомах в перинуклеарной области клетки. Эти результаты указывают на то, что активность PI3K необходима для транспорта ACLDL из ранних эндосом в поздние.

Вортманнин влияет на локализацию стабилина-1 в человеческих макрофагах

Ранее было показано, что стабилин-1 присутствует в эндоцитозном компартименте в первичных человеческих макрофагах (Kzhyshkowska et al, 2004a). Поэтому было исследовано влияние вортманнина на внутриклеточное распределение стабилина-1 в этих клетках. Было обнаружено, что вортманнин приводит к образованию как очень маленьких, так и увеличенных EEA1-позитивных везикул, в то время как интенсивность окраски практически не изменялось, указывая на то, что вортманнин не влияет на ассоциацию ЕЕА1 с ранними эндосомами. Кроме того обработка вортманнином приводила к преимущественному накоплению стабилина-1 в увеличенных эндосомах и приводила к снижению количества стабилин-1-позитивных везикул.

Таким образом, было показано, что стабилин-1 участвует в эндоцитозе и внутриклеточном транспорте ACLDL в макрофагах. Активность PI3 киназы необходима для транспортировки ACLDL из ранних в поздние эндосомы, а так же для нормального внутриклеточного распределения стабилина-1 в первичных человеческих макрофагах второго типа.

Молекулярная гетерогенность популяции макрофагов второго типа

Исследования макрофагов второго типа, экспрессирующих стабилин-1 указывают на то, что этот тип макрофагов обладает уникальными функциональными особенностями, которые обеспечиваются специфичным молекулярным репертуаром. Действительно, поиск маркеров моноцитов второго типа проведенный до 1999 года позволил описать АМАС-1 (Kodelja et al, 1998), маннозный рецептор (Stein et al, 1992) и CD163 (Hogger et al, 1998). Можно, однако, предположить, что функция макрофагов второго типа обеспечивается бoльшим числом специфично экспрессирующихся генов. Обнаружение этих генов и исследование их функций позволило бы лучше понять механизм развития макрофагов второго типа и их роль в функционировании здорового организма и в патологии. Поэтому в данной работе специфичный молекулярный репертуар макрофагов второго типа был исследован в различных условиях и с использованием различных экспериментальных подходов.

Поиск дифференциально экспрессирующихся генов

Сравнение молекулярного репертуара макрофагов стимулированных IL-4 и IFN было проведено при помощи субтрактивной гибридизации. В результате анализа более чем 20000 полученных клонов, была выявлена дифференциальная экспрессия генов фибронектина, IG-H3 и ряда других генов, для которых активация IL-4 была описана ранее.

Анализ экспрессии фибронектина и IG-H3 в макрофагах

Анализ экспрессии фибронектина и IG-H3 проводился при помощи Норзерн блот гибридизации. Было показано, что экспрессия фибронектина повышена в макрофагах при стимуляции IL-4 (Рис. 5A дорожка 3). При использовании комбинации IL-4 и дексаметазона наблюдалась пониженная, по сравнению со стимуляцией IL-4, экспрессия фибронектина (Рис. 5A, дорожка 5). Анализ сплайсинга фибронектина показал, что IL-4 зависимое повышение экспрессии достигается прежде всего за счет активации экспрессии EDA-негативного варианта, характерного для заживающих ран и эмбрионального развития.

Структура экспрессии гена IG-H3 отличался от структуры экспрессии фибронектина, прежде всего более существенной базальной экспрессией гена в контрольных клетках и клетках стимулированных IFN (Рис. 5В, дорожки 1, 2, 6 и 8). При этом, так же как и в случае с фибронектином, наблюдалась активация экспрессии гена при стимуляции макрофагов IL-4 (Рис. 5В дорожки 3 и 8) и ее подавление при стимуляции дексаметазоном (Рис. 5В, дорожки 4, 5, 9 и 10).

Рисунок 5. Анализ экспрессии МРНК фибронектина (А) и IG-H3 (В) в различных популяциях макрофагов. В качестве контроля использована гибридизация с пробой к GAPDH (С). Макрофаги были стимулированы IFN (дорожки 2 и 7), IL-4 (дорожки 3 и 8), дексаметазоном (дорожки 4 и 9), IL-4 в комбинации с дексаметазоном (дорожки 5 и 10). РНК, полученная из контрольных макрофагов, нанесена в дорожках 1 и 6. Клетки культивировали 3 дня (дорожки 1-5) или 6 дней (дорожки 6-10).

Синтез компонентов внеклеточного матрикса и ферментов для его ремоделлинга стимулируется IL-4 и подавляется дексаметазоном

Различия, обнаруженные при исследовании маркеров макрофагов второго типа при помощи субтрактивной гибридизации указывают на разницу в фенотипе между макрофагами, дифференцированными в присутствии IL-4 и дексаметазона. Для дальнейшего исследования различий между макрофагами стимулированными IL-4 (M2IL-4) и глюкокортикоидом (M2ГК) были выбраны компоненты внеклеточного матрикса и ферменты необходимые для его перестройки (матриксные металлопротеиназы и трансглютаминазы). При помощи количественной ПЦР было показано, что экспрессия МРНК гена tenascin-C повышена в M2IL-4 в 8 раз, по сравнению с контрольными макрофагами. Так же, как и в случае с фибронектином, дексаметазон подавлял экспрессию tenascin-C до уровня наблюдаемого в контрольных макрофагах (Рис. 6В).

Рисунок 6. Анализ регуляции экспрессии компонентов внеклеточного матрикса и ферментов для его перестройки. Анализ экспрессии фибронектина (А), tenascin-С (В), матриксной металлопротеиназы 1 (C), матриксной металлопротеиназы 12 (D), тканевой трансглютаминазы (E), фактора коагуляции XIIIA (F) при помощи количественной ПЦР. Макрофаги культивировали в течение 6 дней при указанной стимуляции. Экспрессия генов при стимуляции IL-4 взята за 100%. Анализ экспрессии фактора коагуляции XIIIA Вестерн блоттингом (G).

Далее было показано, что IL-4 повышает экспрессию МРНК как MMP-1, так и MMP-12 (Рис. 6 С, D). При этом дексаметазон эффективно подавлял индуцированную IL-4 экспрессию MMP-12 (Рис. 6D), но не влиял на индуцированную IL-4 экспрессию MMP-1 (Рис. 6C). Стоит отметить, что обе металлопротеиназы экспрессировались в контрольных макрофагах, но отсутствовали в макрофагах, стимулированных IFN (M1) (Рис. 6C, D). Аналогично tenascin-C и MMP-12 экспрессия тканевой трансглютаминазы (TTG), основного источника трансглютаминазной активности макрофагов, повышалась примерно в 10 раз при стимуляции клеток IL-4. Как и ожидалось, эта стимуляция полностью нивелировалась дексаметазоном (Рис. 6E). При этом экспрессия другой трансглютаминазы - фактора коагуляции XIIIA (FXIIIA) наиболее существенно активировалась комбинацией IL-4 и дексаметазона. Каждый из этих стимуляторов в отдельности приводил лишь к незначительному повышению уровня экспрессии (Рис. 6F). Таким образом, за исключением регуляции экспрессии FXIIIA, полученные результаты указывают на то, что IL-4 активирует продукцию различных компонентов внеклеточного матрикса, а так же ферментов для его перестройки. В то же время глюкокортикоиды способны эффективно подавлять эту активацию, что согласуется с наблюдаемым в клинической практике подавляющим эффектом глюкокортикоидов на заживление ран.

IL-4 запускает, а глюкокортикоиды модулируют продукцию цитокинов макрофагами второго типа

Для дальнейшего описания различий между макрофагами, стимулированными IL-4 и дексаметазоном, были выбраны цитокины, продукция которых типична для макрофагов второго типа: AMAC-1, TARC и MCP-4. Для AMAC-1 ранее было показано, что его продукция активируется IL-4, но не дексаметазоном (Kodelja et al, 1998). Экспрессия TARC и MCP-4 описана для дендритных клеток, полученных из первичных моноцитов при стимуляции последних IL-4 (Hashimoto et al, 1999). Кроме того, было показано, что IL-4 стимулирует продукцию TARC и MCP-4 в клетках гладкой мускулатуры бронхов (Faffe et al, 2003) и клетках эпителия бронхов (Stellato et al, 1999). Анализ продукции цитокинов в культуральной среде показал, что IL-4 необходим для активации продукции всех исследованных цитокинов. В то же время дексаметазон оказался неспособен самостоятельно активировать продукцию этих цитокинов и лишь модулировал эффект IL-4. (Рис. 7).

Рисунок 7. Анализ продукции цитокинов макрофагами через 6 дней культивирования. Концентрации цитокинов в культуральной среде были определены при помощи ELISA.

Глюкокортикоиды стимулируют фагоцитоз и экспрессию скавенджер-рецепторов

Исследование фагоцитарной активности различных популяций макрофагов показали, что стимуляция макрофагов дексаметазоном приводила к повышению фагоцитоза латексных шариков до 160% по сравнению с контрольными макрофагами, при этом IFN подавлял ее до 40%. IL-4 не оказывал существенного влияния на степень фагоцитоза, если использовался в одиночку, но незначительно снижал фагоцитарную активность простимулированную дексаметазоном (Рис. 8A). При использовании опсонизированных и неопсонизированных FITC-меченных бактерий E.coli были получены аналогичные результаты (Рис. 8B). Наблюдавшаяся разница в фагоцитарной активности может быть объяснена разницей в спектре экспрессии скавенджер рецепторов. При помощи количественной ПЦР было показано, что дексаметазон существенно повышает уровень экспрессии HMARCO и CD163 (Рис. 8C, E). Экспрессия макрофагального маннозного рецептора (MMR) повышалась под воздействием как IL-4, так и дексаметазона. При использовании комбинации IL-4 и дексаметазона обнаруживался синергизм действия этих двух факторов (Рис. 8D).

Рисунок 8. A-B: Фагоцитоз латексных шариков (A) неопсонизированных (закрашенные столбцы) и опсонизированных (незакрашенные столбцы) бактерий E.coli (B) различными типами макрофагов. Фагоцитоз латексных шариков (A) или не опсонизированных бактерий E.coli (B) контрольными макрофагами взят за 100%. Все эксперименты повторены не менее 5 раз. C: Анализ экспрессии HMARCO при помощи количественной ПЦР. Экспрессия в макрофагах, стимулированных IL-4, взята за 100%. D,E: Анализ экспрессии MMR (D) и CD163 (E) при помощи проточной цитометрии. Эксперименты были повторены не менее 3 раз с похожим результатом.

Таким образом, было показано, что различные стимуляторы, способные вызвать дифференцировку макрофагов второго типа не обязательно приводят к экспрессии одинаковых маркеров и одинаковой функциональной активности. Эти данные позволяют предположить, что каждый цитокин или гормон, способный воздействовать на моноциты/макрофаги, приводит к развитию специфичного для него фенотипа макрофагов.

Исследование пластичности макрофагального фенотипа

Анализ пластичности макрофагов и их способности реагировать на изменяющееся микроокружение неотделим от понимания механизма взаимодействия между врожденным и приобретенным иммунитетом. На данном этапе работы была исследована способность макрофагов поляризованных в Th1 или Th2 среде, отвечать на вторичные про- или противовоспалительные сигналы.

Анализ экспрессии рецепторов к цитокинам на Th1/Th2 поляризованных макрофагах

Исследование зависимости экспрессии рецепторов макрофагов от типа стимуляции показали, что как М2IL-4 так и М1IFN экспрессируют сравнимые количества IFNRI. Экспрессия IFNRI была незначительно повышена на поверхности макрофагов, стимулированных IL-4 в комбинации с дексаметазоном (М2IL-4/ГК) (Рис. 9). Экспрессия IL-4R определялась только на поверхности контрольных макрофагов и М1IFN (Рис. 9).

Рисунок 9. Анализ экспрессии IL-4R, IFNRI и CD14 на поверхности макрофагов на 3-й день культуры.

Рисунок 10. Анализ экспрессии МРНК TLR4 и MD2 при помощи количественной ПЦР. Макрофаги стимулировали 3 и 6 дней как указано, после чего анализировали экспрессию TLR4 (A) и MD-2 (B). Все эксперименты были повторены не менее 3 раз.

Исследование рецепторов, участвующих в узнавании LPS выявило снижение поверхностной экспрессии CD14 на поверхности М2IL-4. Все остальные исследованные популяции макрофагов экспрессировали похожие количества CD14 (Рис. 9). Экспрессия TLR4 и MD2 была проанализирована на уровне МРНК при помощи количественной ПЦР. Анализ показал, что количество транскриптов TLR4 повышено в случае М2IL-4/ГК (Рис. 10A). Аналогично дексаметазон усиливал экспрессию МРНК гена MD2. М1IFN и М2IL-4 практически не отличались по уровню экспрессии МРНК TLR4 и MD2 (Рис. 10B).

Анализ экспрессии внутриклеточного сенсора MDP - NOD2 так же был проведен на уровне МРНК. Количественная ПЦР показала, что количество транскриптов NOD2 не зависит от стимуляции макрофагов.

Исходя из полученных данных, был сделан вывод, что способность макрофагов распознавать про- или противовоспалительные сигналы не зависит от условий их дифференцировки. При этом дексаметазон влияет не экспрессию системы рецепторов, отвечающих за распознавание патогена.

Продукция противовоспалительных цитокинов активируется при вторичной стимуляции Th2-ассоциированными цитокинами и глюкокортикоидами

Для анализа ответа различных популяций макрофагов на стимуляцию Th2-цитокинами, были выбраны следующие маркеры: AMAC-1 (CCL18) и антагонист рецептора к IL-1 (IL-1ra). Различные популяции макрофагов стимулировли IL-4, IL-4/ГК или IL-10 и определяли концентрации AMAC-1 и IL-1ra при помощи ELISA.

Рисунок 11. Анализ продукции AMAC-1 и IL-1ra Макрофаги, престимулированные в течение 6 дней стимулировали, как указано на рисунке. Концентрации AMAC-1 (A и B) и IL-1ra (C) измеряли в культуральной среде при помощи ELISA. Эксперимент был повторен не менее 3 раз.

Во всех популяциях макрофагов была обнаружена продукция AMAC-1. IL-4 эффективно активировал продукцию AMAC-1 в клетках, которые не производили его в результате первичной стимуляции - контрольных и стимулированных IFN макрофагах (Рис. 11А). При использовании для вторичной стимуляции IL-10 было обнаружено, что IL-10 способен не только активировать продукцию AMAC-1 в М1IFN и нестимулированных макрофагах, но и усиливать продукцию AMAC-1 в М2IL-4 и М2IL-4/ГК (Рис. 11). Следует отметить, что, несмотря на очевидную активацию Th2 цитокинами и дексаметазоном продукции AMAC-1 в макрофагах первого типа - М1IFN и контрольных макрофагах, эффективность этой продукции была существенно ниже, чем в макрофагах второго типа. Так же как и в случае с AMAC-1, IL-4 был способен активировать эффективную продукцию IL-1ra контрольных макрофагах и М1IFN (Рис. 11).

Зрелые макрофаги производят провоспалительные цитокины в ответ на бактериальные продукты, но не Th1 цитокин IFN-gamma

Для исследования способности зрелых макрофагов отвечать на вторичные провоспалительные стимулы, в качестве индикаторов эффективного ответа были выбраны провоспалительные цитокины TNF и IL-1, и Th1 цитокин IL-12. Для вторичной стимуляции использовали мурамил-дипептид (MDP), липополисахарид (LPS) и Th1 цитокин IFN. Несмотря на то, что при первичной стимуляции моноцитов IFN наблюдается продукция значительных количеств TNF и IL-1, в зрелых макрофагах IFN оказался неспособным активировать продукцию этих цитокинов (Рис. 12A, B).

Способность зрелых макрофагов реагировать на бактериальные продукты была исследована в тех же экспериментальных условиях. Эксперимент показал, что М1IFN и М2IL-4 производят сравнимые количества TNF (Рис. 12A). Существенно меньшие, но измеряемые количества TNF производились М2IL-4/ГК и контрольными макрофагами (Рис. 12A). На основании этих данных можно утверждать, что, независимо от стимуляции, зрелые макрофаги сохраняют способность отвечать на стимуляцию липополисахаридом, производя TNF. Похожим образом, стимуляция липополисахаридом приводила к продукции IL-1 всеми популяциями макрофагов. Исследование экспрессии МРНК IL-12p40 проводилось при помощи количественной ПЦР. Было показано, что наиболее эффективно липополисахарид активировал экспрессию IL-12p40 в контрольных макрофагах (Рис. 12C). М2IL-4 и М2IL-4/ГК экспрессировали меньшие количества IL-12p40, в то время как в М1IFN экспрессия МРНК IL-12p40 вообще не была активирована LPS (Рис. 12C).

Кроме липополисахарида способность стимулировать воспалительный ответ в зрелых макрофагах была исследована для мурамил-дипептида (MDP) - синтетического аналога компонента бактериальной стенки. Так же как и LPS, MDP эффективно активировал продукцию TNF и IL-1 в М1IFN. Значительно более слабым был эффект MDP на контрольные макрофаги и М2IL-4. В случае же с макрофагами, стимулированными IL-4 в комбинации с дексаметазоном, MDP был неспособен активировать продукцию цитокинов.

Рисунок 12. LPS активирует продукцию TNF и ИЛ-1 и экспрессию МРНК IL-12p40. Макрофаги престимулировали в течение 6 дней и стимулировали IFN или LPS в течение 6 часов. Продукция TNF (A) и IL-1 (B) была исследована в культуральной среде при помощи ELISA. Экспрессию МРНК IL-12p40 (C) исследовали при помощи количественной ПЦР в макрофагах стимулированных IFN или LPS в течение 2 часов. Эксперимент был повторен не менее 3 раз.

Полученные данные указывают на то, что зрелые макрофаги способны эффективно реагировать на внешние провоспалительные стимулы. При этом тип дифференцировки определяет степень ответа и спектр производимых цитокинов.

Кинетика продукции цитокинов

Разница в пре-стимуляции может приводить к феномену, когда одна и та же вторичная стимуляция использует различные пути передачи сигнала для достижения одного и того же эффекта. Однако, как правило, различные пути передачи сигнала, различаются по скорости и, как следствие, по кинетике ответа. Исходя из этого было предположено, что если продукция цитокинов регулируется различными сигнальными путями, то можно ожидать разницы в кинетике этих процессов. Для проверки этой гипотезы кинетика продукции цитокинов AMAC-1 и TNF были исследованы при вторичной стимуляции макрофагов IL-4 и LPS соответственно. Кинетику продукции цитокинов исследовали на протяжении 48 часов непрерывной стимуляции. Было обнаружено, что кинетики продукции AMAC-1 и TNF одинаковы для всех типов зрелых макрофагов (Рис. 13). Эти данные указывают на то, что макрофаги, престимулированные IFN или IL-4, скорее всего, используют один и тот же молекулярный механизм для ответа на Th2 цитокины или бактериальные продукты, а тип пре-стимуляции определяет только степень продукции цитокинов.

Рисунок 13. Кинетика продукции AMAC-1 и TNF. Макрофаги престимулировали 6 дней и стимулировали IL-4 (A) или LPS (B) как указано. Концентрации AMAC-1 (A) и TNF (B) измеряли в культуральной среде при помощи ELISA. Все эксперименты были повторены 3 раза.

Анализ фагоцитозной активности макрофагов после вторичной стимуляции

Так как макрофаги второго типа проявляют более высокую фагоцитарную активность, чем макрофаги первого типа, было исследовано влияние вторичной стимуляции на фагоцитарную активность зрелых макрофагов (Gratchev et al, 2005). Проточная цитометрия позволила обнаружить, что уже после 24 часов, стимуляция макрофагов второго типа IFN приводила к значительному снижению фагоцитарной активности М2IL-4 и М2IL-4/ГК (Рис. 14), в то время как IL-4 и IL-4/дексаметазон не оказывали существенного влияния на контрольные макрофаги или М1IFN (Рис. 14). Незначительное, но статистически значимое увеличение фагоцитарной активности М1IFN при вторичной стимуляции макрофагов IL-4 и IL-4/дексаметазон наблюдалось через 5 дней стимуляции (Рис. 14).

Рисунок 14. Анализ фагоцитарной активности макрофагов. Макрофаги престимулировали 6 дней и стимулировали, как указано в течение 24 часов или 5 дней. Фагоцитарная активность определялась как величина средней интенсивности флуоресценции, полученная при помощи FITC-меченных латексных шариков и проточной цитометрии. Для анализа статистической значимости полученных результатов был использован парный двухвыборочный т-тест Стьюдента.

Анализ бактерицидной активности макрофагов после вторичной стимуляции

В отличие от макрофагов второго типа, макрофаги первого типа способны более эффективно уничтожать патогены (Gratchev et al, 2001b). Поэтому, далее была исследована способность зрелых макрофагов изменять свою бактерицидную активность под действием Th1 и Th2 цитокинов и бактериальных продуктов. Было обнаружено, что стимуляция макрофагов IL-4 или его комбинацией с дексаметазоном приводила к 10-и кратному снижению бактерицидной активности контрольных макрофагов и М1IFN (Рис. 15). При этом стимуляция макрофагов IFN приводила к 15-20-кратному повышению бактерицидной активности контрольных макрофагов, М2IL-4 и М2IL-4/ГК (Рис. 15). Стоит особо отметить, что LPS не влиял ни на фагоцитарную, ни на бактерицидную активность макрофагов (Рис. 14, 15). Можно сделать вывод, что LPS активирует, прежде всего, цитокиновый ответ макрофагов, но не изменяет функциональное состояние клеток. Обратное справедливо для IFN-?, который изменяет функциональное состояние клетки, но не активирует продукцию цитокинов.

Таким образом, было показано, что стимуляция зрелых М1IFN?Th2 цитокинами приводит к активации продукции противовоспалительных цитокинов, увеличивает фагоцитарную и снижает бактерицидную активность. В то же время IFN активно стимулирует бактерицидную и снижает фагоцитарную активность М2, не активируя продукции цитокинов. Бактериальные продукты, такие как LPS и MDP способны активировать все популяции макрофагов. Эти данные указывают на то, что зрелые макрофаги способны адекватно реагировать на широкий спектр эндогенных и экзогенных стимулов независимо от первоначальной стимуляции.

Рисунок 15. Анализ бактерицидной активности макрофагов. Макрофаги престимулировали 6 дней и стимулировали, как указано. Бактерицидная активность определялась, как описано в материалах и методах. В каждом эксперименте бактерицидная активность М1IFN была взята за 100%. Для анализа статистической значимости полученных результатов был использован парный двухвыборочный т-тест Стьюдента.

Накопленные знания позволяют утверждать, что макрофаги в организме человека нельзя разделить на 2 категории: классически и альтернативно активированные. Скорее, систему мононуклеарных фагоцитов можно представить в виде континуума функциональных состояний, на одном из полюсов которого находятся макрофаги, активно восстанавливающие ткань после подавления воспалительной реакции, а на другом - макрофаги, активно стимулирующие воспаление. Нейтральное состояние, соответствующее здоровой неповрежденной ткани будет находиться между этих 2-х полюсов (Рис. 16) (Gratchev et al, 2005; Gratchev et al, 2006).

Рисунок 16. Изменение фенотипа макрофагов в процессе воспалительной реакции.

Разнообразие макрофагальных фенотипов объясняется не только различными комбинациями факторов, воздействующих на клетку, но также и последовательностью воздействия этих факторов. Так было показано, что макрофаги, обработанные IFN за несколько часов до стимуляции липополисахаридом, были способны производить большие количества TNF (Hayes et al, 1995a), кроме того обработка IFN ведет к изменению ответа на IL-10 (Herrero et al, 2003). Способность макрофагов отвечать на различные стимулы независимо от фенотипа и степени дифференцировки привела к созданию концепции пластичности макрофагального фенотипа (Gratchev et al, 2006; Stout and Suttles, 2004). В соответствии с этой концепцией макрофаги рассматриваются как клетки, обладающие способностью изменять свое состояние в пределах континуума возможных состояний в зависимости от изменений, произошедших в их микроокружении среде. Так независимо от фенотипа макрофаги способны адекватно ответить на молекулярные структуры патогенов (PAMPS от «pathogen association molecular patterns») такие как LPS или MDP. Также макрофаги, участвующие в стимуляции воспалительной реакции, способны ответить на противовоспалительные сигналы и понизить свой воспалительный потенциал (Gratchev et al, 2006).

Анализ IL17BR - маркера макрофагов второго типа

IL-17Е (IL-25) принадлежит к семейству цитокинов IL-17, которое включает 5 белков с уровнем белковой гомологии от 20 до 50%. В отличие от остальных членов семейства, IL-17Е вызывает экспрессию Th2 ассоциированных цитокинов IL-4, IL-5 и IL-13 (Fort et al, 2001). IL-17E производится субпопуляцией Th2 поляризованных Т-клеток (Fort et al, 2001), а так же тучными клетками (Ikeda et al, 2003). В мышиной модели повышенная продукция IL-17E приводила к развитию Th2-патологий, эозинофилии легких (Hurst et al, 2002), и повышенной продукции слизи в легких и пищеварительном тракте (Fort et al, 2001; Pan et al, 2001). Рецептор к IL-17Е был первоначально описан как рецептор к IL-17В, откуда и появилось название IL-17RB (Shi et al, 2000). Другие наименования этого рецептора - IL-17 receptor homolog 1 (IL-17Rh1) (Lee et al, 2001) и EVI27 (Tian et al, 2000).

Наши первичные данные указывали на то, что стимуляция макрофагов IL-4 приводит к активации экспрессии IL-17RB. Поэтому был поставлен вопрос о спектре цитокинов, влияющих на экспрессию этого рецептора и о возможности использования его как маркера определенной популяции макрофагов.

Анализ экспрессии IL-17BR в М1, М2IL-4 и М2IL-4/TGF показал, что в макрофагах стимулированных IL-4 экспрессия МРНК IL-17BR в среднем в 10 раз выше, чем в макрофагах, стимулированных IFN (M1). Эта экспрессия усиливалась при добавлении к IL-4 трансформирующего фактора роста бета (TGF). Далее было исследовано, каким образом другие Th2 ассоциированные цитокины (IL-10, IL-13 и TGF) или глюкокортикоиды влияют на экспрессию IL-17BR. Количественная ПЦР показала, что IL-13, подобно IL-4 активирует экспрессию IL-17BR, хотя и не усиливает эффект IL-4 (Рис. 17). Дексаметазон подавлял экспрессию IL-17BR активированную IL-4?(Рис. 17). IL-10 сам по себе не был способен активировать экспрессию рецептора, но несколько усиливал эффект IL-4. Наиболее сильный эффект наблюдался в случае TGF, который существенно усиливал эффект IL-4, хотя будучи использован сам по был неспособен активировать экспрессию рецептора (Рис. 17). При этом экспрессия IL-17BR, наблюдавшаяся в почках - органе, с высоким уровнем эндогенной экспрессии IL-17BR (Shi et al, 2000), была сравнима с экспрессией в макрофагах, стимулированных IL-4 или IL-13 (Рис. 17). Данные полученные на уровне МРНК были подтветрждены данными Вестерн блоттинга (Рис. 18С).

Рисунок 17. Анализ экспрессии IL-17BR методом количественной ПЦР. Макрофаги культивировали 6 дней в присутствии указанных цитокинов и/или дексаметазона. Экспрессия IL-17BR в M2IL-4 была взята за 100%. Представлены средние величины, полученные по результатам 3 экспериментов.

Анализ сплайс-вариантов IL-17BR

Анализ базы данных EST выявил наличие нескольких возможных сплайс вариантов МРНК IL-17BR (Moseley et al, 2003) соответствующих мембран-связанной и растворимой формам рецептора. Экспрессию растворимой формы IL-17BR - SIL-17BR исследовали при помощи ПЦР, с праймерами расположенными внутри 8-го интрона. Эксперимент показал, что SIL-17BR экспрессируется в макрофагах, стимулированных IL-4 и IL-4 в комбинации с TGF (Рис. 18A). С помощью количественной ПЦР было измерено общее количество транскриптов IL-17BR и отдельно количество т