Рассмотрение биотехнологии сельскохозяйственных животных. Изменение хозяйственно-ценных признаков. Исследование методов получения трансгенных особей с интегрированными генными конструкциями. Получение животных продуцентов биологически активных веществ.
Аннотация к работе
В настоящее время используются несколько подходов в получении трансгенных животных. Оптимальные условия для проведения микроинъекций в пронуклеусы зигот мышей описаны в работе Бринстера и соавторов (1994). Интеграция нескольких копий (от 1 до нескольких сотен) экзогенной ДНК в геном происходит, как правило, в одном сайте в ориентации "голова к хвосту" или "голова к голове". Другой подход в получении трансгенных животных заключается в инфицировании ранних эмбрионов млекопитающих рекомбинантными ретровирусами.К ним относится использование в конструкциях репортерных генов, таких как ?-галактозидаза, щелочная фосфотаза и др., а также определение трансгенов в эмбрионах методом ПЦР и флюоресцентной гибридизации. Геномные РНК ретровирусов содержат на свох концах повторяющиеся последовательности, которые в зависимости от типа вируса имеют длину от 10 до 80 нуклеотидов. На 3" конце геномной РНК R-сегмента расположен регион U3 длиной 170-1250 нуклеотидов, а на 5" конце r-сегмента регион u5 длиной 80-100 нуклеотидов.При образовании ДНК-копии вирусного РНК-генома на концах молекулы происходят изменения: на 5" конце располагается сегмент U3, а на 5" - U5.Такие характерные для ДНК-формы ретровирусоа участки получили название LTR - длинных концевых повторов. У одних вирусов кор, состоящий из белка gag, РНК-зависимой ДНК-полимеразы (реверсивной транскриптазы), интегразы и двух копий ретровирусной РНК, переносится в ядро, где и происходит транскрипция, а у других вирусов транскрипция осуществляется непосредственно в цитоплазме. В векторной конструкции (провирусная ДНК) гены, кодируюрущие структурные белки ретровируса (gag, pol, env),замешают другими интересующими генами (генами ?-галактозидазы и устойчивости к неомицину).Кроме того, ограниченные знания регуляторных последовательностей большинства генов приводят к использованию зачастую полностью не охарактеризованных геномных фрагментов, что и является причиной низкой эффективности экспрессии в экспериментах по переносу генов [Palmlter, Brinster, 1986]. Для того чтобы преодолеть позиционный эффект и таким образом увеличить вероятность оптимальной экспрессии трансгенов, интегированных в случайной локализации, был применен целый ряд различных стратегий. Положительное влияние на уровень экспрессии трансгенов оказывало введение в генные конструкции S/MAR-элементов Наиболее удачным решением проблемы преодоления позиционного эффекта явилось интеграция в определенный участок генома посредством гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках, так как это обеспечивает контроль трансгенной конструкции всеми регуляторными последовательностями, присутствующими в выбранном эндогенном локусе. Еще одним подходом, позволившим дайной интеграции трансгена в геном хозяина является включение в генные конструкции всех регуляторных элементов, ответственных за его экспрессию.Например, трансгенные животные (свиньи, куры, кролики) с геном гормона роста при равных условиях характеризуются повышенными темпами роста. Другим важнейшим направлением генной инженерии является получение трансгенных особей с интегрированными в геном генными конструкциями, связанными с усилением иммунитета животных к инфекционным заболеваниям. Первым экземпляром трангенного животного стала мышь, размерами вдвое превосходящая обычную особь в нее был введен ген, синтезирующий гормон роста крысы. Принципиальная возможность специфической экспрессии трансгенов протеина молока и чужеродных протеинов в молочной железе была продемонстрирована в экспериментах на мышах, кроликах, свиньях, овцах, козах. Среди сельскохозяйственных животных получение и использование трансгенных мелких жвачных значительно дешевле (на единицу биологической продукции), чем коров, т. к. овцы и козы обладают коротким репродуктивным периодом и в случае интенсивной экспрессии соответствующего гена сразу же открывается возможность быстрого размножения трансгенных животных, создание промышленного стада продуцентов и перманентных линий трансгенных животных, экспресси-рующих желаемые протеины.