Генная инженерия - Методичка

Генная инженерия (синонимы: генетическая инженерия, ДНК-технологии) - это отрасль биологической технологии, задачей которой является конструирование in vitro новых молекулярных генетических систем и последующее встраивание их в геномы организмов. Иными словами, методами генной инженерии в лабораторных условиях генетический материал из одного организма (который принято называть источником или донором генов) переносится в другой организм (называемый хозяином или реципиентом). Целью данных манипуляций является получение организмов с новыми заданными полезными для человека генетически обусловленными свойствами.

Перенос генов методами генной инженерии дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и осуществлять передачу отдельных наследственных признаков от одних организмов другим, не родственным им (например, от животных бактериям), чего нельзя достичь методами традиционной селекции.

Вне зависимости от применяемых конкретных методов, типовой генноинженерный эксперимент можно представить в виде последовательности из четырех этапов: 1) получение фрагмента (или смеси фрагментов) ДНК путем расщепления исходной молекулы с помощью специфических ферментов - эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз);

2) конструирование in vitro рекомбинантных молекул ДНК, состоящих из фрагментов, полученных на первом этапе, и небольших автономно реплицирующихся в клетке-реципиенте структур (плазмид, фагов, вирусов), носящих название векторов;

3) введение рекомбинантных молекул ДНК в клетку-реципиент;

4) отбор клонов, несущих нужную рекомбинантную молекулу.

Важнейшим источником донорских молекул ДНК, используемых в генной инженерии, являются фрагменты генетического материала различных организмов. Вторым источником могут быть двунитевые дезоксирибонуклеиновые кислоты, полученные на основе однонитевой ДНК комплементарной МРНК эукариотических организмов (дн-КДНК). Подобные копии применяются для экспрессии в бактериях важных с медицинской точки зрения белков человека и животных. Третий источник - искусственные молекулы ДНК, полученные путем химико-ферментативного синтеза.

Практическое занятие №1

Тема: Методы конструирования рекомбинантных ДНК in vitro

Конструирование рекомбинантных молекул ДНК, независимо от выбранного метода, сводится к следующим задачам: 1) Получение целевого фрагмента (или смеси фрагментов) ДНК путем разрезания с помощью рестриктаз молекулы ДНК, выделенной из конкретного организма.

2) Разрезание векторной молекулы с помощью рестриктазы в определенном участке (сайте рестрикции).

3) Вставка и последующее вшивание целевого фрагмента ДНК в вектор в месте разреза.

Впервые подобная операция была произведена в 1972 г. группой американских генетиков из Стенфордского университета под руководством Пола Берга. Ими была получена in vitro гибридная молекула, состоящей из ДНК вируса SV40 и ДНК фага ?dvgal. Использованный при этом алгоритм действий получил название коннекторного метода. В 1980 г. за свое открытие Пол Берг был удостоен Нобелевской премии в области химии.

Принцип коннекторного метода (см. рис. 1). К 3"-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью фермента терминальная трансфераза достраивают одноцепочечные сегменты определенной длины, состоящие из адениновых нуклеотидов (олиго(DA)-сегменты), а к концам другого фрагмента - комплементарные им олиго(DT)-сегменты (состоящие из тиминовых оснований) примерно такой же длины. При смешении полученных таким образом фрагментов формируются кольцевые структуры за счет водородных связей между олиго(DA)- и олиго(DT)-последовательностями. Одноцепочечные бреши гибридных молекул ДНК застраивают с помощью ДНК-полимеразы и цепи ковалентно сшивают в лигазной реакции.

Рис. 1. Схема коннекторного метода создания рекомбинантных ДНК

На следующий год после экспериментов П. Берга, другой американский биохимик С. Коэн с сотрудниками предложил более простой метод конструирования гибридных молекул ДНК, основанный на применении двух ферментов: рестриктазы и ДНК-лигазы. Рестриктазно-лигазный метод быстро завоевал популярность и используется до сих пор как наиболее простой и надежный.

Принцип рестриктазно-лигазного метода. Данный метод состоит из трех этапов (см. рис. 2): 1) рестриктазой класса II специфически разрезают молекулы ДНК на фрагменты, имеющие идентичные взаимокомплементарные липкие концы;

2) препараты различных молекул ДНК, гидролизованных одной и той же рестриктазой, смешивают, и при определенных условиях липкие концы разных фрагментов ДНК реассоциируют за счет комплементарного взаимодействия;

3) с помощью ДНК-лигазы происходит ковалентное связывание ассоциированных фрагментов ДНК.

Рис. 2.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Методы конструирования рекомбинантных ДНК in vitro

Методы введения рекомбинантных ДНК в клетки

Методы идентификации клонов, содержащих рекомбинантные ДНК

Методы секвенирования

Амплификация последовательности ДНК in vitro

Генетически модифицированные микроорганизмы и их использование

Получение трансгенных растений, устойчивых к неблагоприятным факторам внешней среды

Получение трансгенных растений с улучшенными пищевыми свойствами

Конструирование трансгенных растений - продуцентов целевых белков

Создание и применение трансгенных животных

Генотерапия

Краткий словарь терминов

Вопросы для самостоятельного изучения

Вопросы итогового контроля

Список рекомендуемой литературы

ВВЕДЕНИЕ

1. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: учеб. пособие для вузов. - 2-е изд., испр. и доп. - Новосибирск: Сибир. университет. изд-во, 2004. - 496с.:ил. - ISBN 5-94087-098-8

2. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии : учеб. пособие для студентов вузов. - М.: Academia, 2003. - 208с. : ил. - (Высшее образование). - ISBN 5-7695-1022-6

3. Красноштанова А.А., Крылов И.А., Бабусенко Е.С. Основы биотехнологии: учеб. Пособие. - М.: РХТУ, 2001. - 84с.:ил. - ISBN 5-7237-0270-X

4. Бакай А.В., Кочиш И.И., Скрипниченко Г.Г. Генетика: учебник для вузов. - М.: КОЛОСС, 2006. - 448с.: ил. - ISBN 5-9532-0325-Х

5. Иванов В.И. [и др.] Генетика: учебник для вузов / под ред. В.И.Иванова. - М.: Академкнига, 2006. - 247с.: ил. - ISBN 5-94628-146-1

6. Франк-Каменецкий М.Д. Век ДНК. - М.: Книжный дом "Университет", 2004. - 239 с. - ISBN 5-98227-017-2

7. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. - М.: Мир, 2002. - 589 с. - ISBN 5-03-003328-9

Размещено на