Внутрішньопородні особливості поліморфізму свиней великої білої породи за генами репродуктивних якостей, а також асоційованих з показниками приросту живої маси. Вплив генотипу на формування господарсько-корисних ознак у тварин, принципи його тестування.
Аннотация к работе
Роботу виконано відповідно до напрямку наукових досліджень відділу молекулярно-діагностичних досліджень Української лабораторії якості і безпеки продукції АПК Національного університету біоресурсів і природокористування України за темами «Вплив генів-кандидатів на господарсько-цінні якості свині свійської» (номер держреєстрації ДР 0107U007936), «Розробка та застосування ДНК-технологій в АПК та природоохоронній сфері для контролю якості і безпеки продукції біологічного походження» (ДР 110/22-л-пр) та за допомоги Чеського наукового фонду №523/03/H076 у молекулярно-діагностичній лабораторії в Аграрному університеті ім. Для реалізації поставленої мети в роботі вирішувались наступні завдання: - вивчити внутрішньопородні особливості поліморфізму свиней великої білої породи за генами репродуктивних якостей: ESR (ген рецептору естрогену), PRLR (ген рецептору пролактину), FSHB (ген фолікулостимулюючого гормону в); дослідити особливості поліморфізму структурних генів, асоційованих з показниками приросту живої маси: MYF4 (ген міогенін фактору), MYOD1 (ген фактору, що детермінує ріст міобластів), MC4R (ген меланокортин4-рецептору), CMYC (ген міогенез-, адипогенез-, фолікулогенезфактору); Методи досліджень: молекулярно-генетичні - екстракція нуклеїнової кислоти, визначення чистоти та концентрації ДНК, ампліфікація фрагментів ДНК методом сайт-специфічної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з наступним рестриктним аналізом (метод ПЛР-ПДРФ, (поліморфізм довжин рестриктних фрагментів)), метод горизонтального електрофорезу ДНК в агарозному гелі; цитогенетичні - культивування лімфоцитів крові, отримання цитогенетичних препаратів, цитогенетичний аналіз, ветеринарні методи - відбір крові шляхом пункції ретробульбарного синусу ока та вени вуха, відбір волосяних фолікулів; статистичні - обробка експериментальних даних із застосуванням сучасних компютерних програм, розробка діагностичних наборів для генотипування свиней за генами, які детермінують господарсько корисні ознаки. Вперше проведено генетичний аналіз популяцій свиней великої білої породи в Україні одночасно за 10 генами, які детермінують господарсько корисні ознаки та за цитогенетичними показниками.Проведено аналіз генетичного поліморфізму свиней великої білої породи в Україні за допомогою молекулярно-генетичних та цитогенетичних маркерів (табл. З метою виявлення особливостей генетичної структури свиней української популяції породи велика біла, за генами асоційованими з репродуктивними якостями, показниками приросту живої маси, резистентністю до колібактеріозів та стрес-стійкістю, проведено аналіз генетичної структури різних груп (популяцій) за 10 локусами господарсько корисних ознак. Досліджувані групи свиней великої білої породи відрізнялись за походженням та умовами утримання: 1) тварини місцевої селекції: група І - господарство ВАТ «Маки»*; с. (матеріал відібрано при плановому забої тварин на «Київському птахокомбінаті»); 2) данської селекції: група ІІ - СП ТОВ «Нива Переяславщини», Переяслав-Хмельницького району Київської обл.; 3) англійської селекції: група ІІІ - ВАТ агрокомбінат «Калита», Броварського району Київської області. За геном ESR досліджено 123 тварини, 60 тварин за генами PRLR, FSHB, MYF4 і RYR, 59 - за генами CMYC, MUC4 і FUT1, та 115 і 105 за генами MYOD1 і MC4R відповідно (табл.В результаті дослідження особливостей генетичної структури української популяції свиней породи велика біла за локусами господарсько корисних ознак, асоційованими з репродуктивними якостями, показниками приросту живої маси, резистентністю до колібактеріозів та стрес-стійкістю, було виявлено поліморфізм за всіма генами, окрім MYOD1. Порівняльний аналіз частот генотипів за генами ESR, PRLR і FSHB зарубіжних дослідників і дані, отримані в наших дослідженнях, свідчить про те, що популяція великої білої породи в Україні характеризується значним генетичним потенціалом за генами-детермінантами репродуктивної функції. Тварини з бажаним генотипом за геном MYF4 зустрічаються з невисокою частотою 3,4%, за геном MC4R - близько 49%, а за геном C-Myc - 67% (рис. Встановлено, що популяція великої білої породи в Україні має 13-17% тварин із резистентним генотипом до колібактеріозів за геном MUC4 та 7% тварин із резистентним генотипом за геном FUT1. Частка тварин резистентних до колібактеріозів (гомозиготні за диким типом гену MUC4 і гомозиготні за мутантним алелем гену FUT1) коливалась в межах від 0 до 6%, а умовно резистентних (гомозиготні за диким типом гену MUC4 і гетерозиготні за мутантним алелем гену FUT1 та/або гомозиготні за мутантним алелем гену FUT1 і гетерозиготні за диким типом гену MUC4) коливалась в межах від 6 до 20%.Розроблено систему оцінки генофондів порід свині свійської (Sus scrofa) за використання молекулярно-генетичних та цитогенетичних маркерів на прикладі великої білої породи. Встановлено особливості внутрішньопородного поліморфізму свиней українського поголівя великої білої породи за 10 генами господарсько корисних ознак і цитогенетичних параметрів. Виявлено, що часто
План
Основний зміст роботи
Вывод
В результаті дослідження особливостей генетичної структури української популяції свиней породи велика біла за локусами господарсько корисних ознак, асоційованими з репродуктивними якостями, показниками приросту живої маси, резистентністю до колібактеріозів та стрес-стійкістю, було виявлено поліморфізм за всіма генами, окрім MYOD1.
Вплив бажаних генотипів на господарсько корисні ознаки S. scrofa наведено у таблиці 3. За усіма дослідженими генами були виявлені тварини-носії господарсько корисних алелів. Частоти генотипів і алелів генів, повязаних з господарсько корисними ознаками у свиней великої білої породи із урахуванням статистичної помилки для частоти генотипу (Sp) та частоти алелів (Sq) (Л.А. Животовский, 1999) наведено у таблиці 4.
Вплив генотипів за дослідженими генами на господарсько корисні ознаки S. scrofa
Ген, локалізація Алелі Бажаний генотип Вплив бажаного генотипу
PRLR (пролактин-рецептор), SSC 16 (q2.2-2.3) А, В A (домінантний) Підвищення репродуктивних якостей свиноматки
ESR (естроген-рецептор), SSC 1 (p2.5-p2.4) А, В (С, D) B (домінантний) (D )
MYF4 (міогенін фактор) А, В ВВ (рецесивний) Збільшення ваги новонароджених поросят
MYOD1 (фактор, що детермінує ріст міобластів) А, В АА, АВ Збільшення показників приросту маси
C-MYC протоонкоген (міогенез-, адипогенез-, фолікулогенез-фактор), SSC4 (р13-14) А, В АА (рецесивний) Збільшення приросту маси тварин
RYR (HAL, CRC, рианодин-рецептор) SSC (6q1.2) N, n N (домінантний) Відсутність стрес-чутливості
Встановлено, що за геном ESR досліджена популяція свиней великої білої породи на 28% (±3,25%) складається з тварин-носіїв бажаного домінантного алелю D, а 17% (±3,39%) з них - гомозиготи DD.
Бажаний алель А гену PRLR виявлено у 57,5% (±2,74%) тварин, 30% (±5,92%) є гомозиготами АА. У досліджених тварин виявлено високу частоту алелю В гену FSHB - 76,7% (±1,50%), а частота бажаного генотипу ВВ за цим геном становить 56,7% (±6,40%).
Порівняльний аналіз частот генотипів за генами ESR, PRLR і FSHB зарубіжних дослідників і дані, отримані в наших дослідженнях, свідчить про те, що популяція великої білої породи в Україні характеризується значним генетичним потенціалом за генами-детермінантами репродуктивної функції.
За генами MYF4, MC4R і CMYC, асоційованими з показниками приросту живої маси свиней було знайдено поліморфізм. На рисунку 3 представлено розподіл частот генотипів S. scrofa породи велика біла за досліджуваними генами.
Тварини з бажаним генотипом за геном MYF4 зустрічаються з невисокою частотою 3,4%, за геном MC4R - близько 49%, а за геном C-Myc - 67% (рис. 3). За геном MYOD1 усі досліджені тварини були з бажаним генотипом АА. Отже, відбір носіїв бажаного генотипу за генами MYF4, MC4R та C-Myc у племінному ядрі може значно поліпшити показники продуктивності товарного поголівя.
Частоти генотипів і алелей генів, повязаних з господарсько корисними ознаками у свиней великої білої породи в Україні
Ген Частота генотипу з репрезентативною помилкою Частота алелю з репрезентативною помилкою
ESR* СС (АА) ± Sp** CD (АВ) ± Sp DD (ВВ) ± Sp C (А) ± Sq*** D (В) ± Sq
В результаті проведених досліджень трьох груп свиней, був виявлений низький рівень поліморфізму за геном RYR. Встановлено, що тварини з генотипом NN, які є стрес-стійкими, становлять переважну більшість серед досліджених і складають 0,975 ± 0,0281. Гетерозиготи Nn у досліджених тварин зустрічались з частою лише 0,025 ± 0,0091, причому, тварини з цим генотипом були виявлені лише в одному господарстві (ВАТ «Маки»). Гомозиготи за мутантним алелем nn, чутливі до стресу, не були виявлені в жодному господарстві. Рецесивний мутантний алель цього гену за даними О.М. Метлицької (2001) був характерний лише для свиней м‘ясних порід України. За результатами наших досліджень частота небажаного алелю n гену RYR у популяції великої білої породи в Україні склала близько 2,5%. Таким чином, бажано проводити генотипування плідників за геном RYR з метою запобігання поширення мутантного алелю в популяції.
Генетична структура популяції свиней великої білої породи за ДНК-маркерами стійкості до колібактеріозів
Мутація у нуклеотидній послідовності гену MUC4 проявляється як шкідлива, в той час, як мутація гену FUT1 проявляється як господарсько корисна. Стійкість свиней до колібактеріозів успадковується як рецесивна ознака, отже, мутація за геном MUC4 є домінантною, а мутація за геном FUT - рецесивною. Наявність обох алелей АА у генотипі за кожним геном асоційована з резистентністю до колібактеріозів. Встановлено, що популяція великої білої породи в Україні має 13-17% тварин із резистентним генотипом до колібактеріозів за геном MUC4 та 7% тварин із резистентним генотипом за геном FUT1. Здійснено розподіл тварин за алелями генів, повязаних резистентністю до колібактеріозів в різних господарствах України. Тварини за генотипами були розподілені на три групи. До першої включено тварин з бажаним генотипом за двома генами. До другої - з бажаним генотипом за одним з генів. Третя група містила небажані генотипи за обома генами. Частка тварин резистентних до колібактеріозів (гомозиготні за диким типом гену MUC4 і гомозиготні за мутантним алелем гену FUT1) коливалась в межах від 0 до 6%, а умовно резистентних (гомозиготні за диким типом гену MUC4 і гетерозиготні за мутантним алелем гену FUT1 та/або гомозиготні за мутантним алелем гену FUT1 і гетерозиготні за диким типом гену MUC4) коливалась в межах від 6 до 20%. Розподіл частот генотипів свиней великої білої породи в Україні по кожному дослідженому гену відповідає закону Харді-Вайнберга. Таким чином, більшість свиней породи велика біла в Україні (від 80 до 91%) є чутливими до інфекцій, викликаних E. coli.
Особливості розподілу алельних варіантів генів і вплив генотипу на формування господарсько корисних ознак в господарствах з різними технологіями утримання тварин
На основі даних, отриманих в результаті генотипування тварин різних груп, визначались частоти алелів генів, генотипів, статистична помилка для кожного показника, а також теоретично очікувані частоти генотипів за законом Харді-Вайнберга. Порівняння теоретично очікуваних та отриманих частот генотипів за генами ESR, PRLR, FSHB, MYF4, MC4R, CMYC, FUT1, MUC4 за допомогою критерію відповідності ЧІ у кожній групі свідчить, що відмінності між теоретично очікуваними і отриманими частотами невірогідні. Це свідчить про те, що досліджені популяції є генетично стабільними за дослідженими молекулярно-генетичними маркерами. Це є суттєвим резервом для інтенсифікації генетичного прогресу популяцій свиней.
В IV групі (ДПДГ «Христинівське» УААН) за геном ожиріння, MC4R, та в групах ІІ і ІІІ (СП ТОВ «Нива Переяславщини» та ВАТ агрокомбінат «Калита») за геном стрес-чутливості (RYR) не знайдено поліморфізму. Так, досліджені тварини з групи IV мали тільки господарсько корисні генотипи (гомозиготи за мутантним рецесивним алелем), за геном MC4R, а досліджені тварини груп ІІ і ІІІ не мали мутантного алелю n гену RYR, який в гомозиготному стані зумовлює чутливість до стресу (синдром MHS).
В усіх досліджених групах, за геном MYOD1 усі тварини виявились гомозиготними носіями господарсько корисних домінантних алелів. Дані свідчать про те, що для племінного розведення у досліджених господарствах, були відібрані тварини з гомозиготними господарсько корисними генотипами.
На основі проведених ДНК-досліджень, можна зробити висновок, що велика біла порода в Україні характеризується високим рівнем поліморфності і гетерозиготності досліджених локусів і, відповідно, має великий резерв генетичної мінливості, а також хороший генетичний потенціал.
Визначення реалізації генотипу за генами репродуктивної функції на показники продуктивності свиней
Враховуючи різні технології виробництва, нами вивчався вплив генів господарсько цінних ознак на репродуктивні показники свиноматок за допомогою дисперсійного аналізу однофакторного комплексу для малої вибірки (Н.А. Плохинский, 1996). В залежності від технології утримання тварин, вплив генотипу коливався від 1% до 38%, а вплив інших факторів - відповідно від 62% до 99%. В усіх досліджених групах генотип за геном ESR найменше впливав на кількість поросят, народжених живими і коливався від 1 до 8%. PRLR впливав на кількість поросят, народжених живими - від 3 до 38%. З результатів дисперсійного аналізу виявилось, що в СП ТОВ «Нива Переяславщини» ген ESR впливає найбільше на кількість опоросів у рік (22%), а у ВАТ агрокомбінат «Калита» ген PRLR - на живу масу новонароджених поросят (38%). Найвищий вплив генотипу за всіма показниками продуктивності спостерігався в господарстві «Калита», а найнижчий - у господарстві ВАТ «Маки». Великі розбіжності у впливі певних генів свідчить про значну залежність реалізації генетичного потенціалу від взаємодії неалельних генів та умов відтворення тварин.
Залежність репродуктивних якостей свиней великої білої породи від алельних варіантів естроген- і пролактин-рецепторів
В усіх дослідних групах (господарствах) свині відрізнялись за співвідношенням генотипів пролактин - та естроген-рецепторів. У ВАТ агрокомбінат «Калита» не виявили тварин небажаного генотипу, бажаний генотип AADD складав 35,7%, а маса новонароджених поросят була вищою, ніж в інших господарствах (p<0,001). У ВАТ «Маки» не було виявлено тварин з небажаним генотипом, тут переважали генотипи AACD (33,3%) та ABCD (33,3%). У СП ТОВ «Нива Переяславщини» було 11,1% тварин з небажаним генотипом ВВСС, відсутні - з генотипом AADD та AACD. Тут переважав генотип АВСС (55,5%).
Отримані дані свідчать про те, що найвищою жива маса новонароджених поросят була у свиноматок генотипу AADD.
У досліджуваних тварин кількість опоросів за рік коливалась від 1,45 (генотип ABCD) до 2,8 (генотип AADD). Мінімальна жива маса новонароджених поросят становила 700 г. (генотип АВСС), максимальна - 1500 г. (генотип AADD), мінімальна кількість поросят за опорос - 5 (у свиноматок ААСС і AACD), максимальна - 19 поросят (у свиноматки ABCD).
Найбільша кількість мертвонароджених поросят була у тварин АВСС.
Серед вибракуваних через нездатність до запліднення, народжування мертвих поросят, аборти свиноматок, переважали тварини з генотипом ВВСС, а також BBDD, АВСС. Найменша кількість мертвих поросят характерна для тварин з генотипом AADD та ABDD.
Оскільки тварини генотипу ВВСС і BBDC були виявлені лише в одному господарстві (СП ТОВ «Нива Переяславщини»), їх не включено до рисунку.
Тварини генотипу AADC були виявлені також лише в одному господарстві ВАТ «Маки». Вищі показники репродуктивної функції спостерігались у свиноматок, у генотипі яких зустрічались алелі A і D естроген- і пролактин-рецепторів.
Дослідження свиней великої білої породи за генетичним маркером приросту живої маси MC4R
У досліджених тварин за геном MC4R спостерігається високий рівень генотипу РР, частоти якого коливаються від 0,16 до 1. У господарстві ДСПГ «Христинівське» УААН усі досліджені тварини мали генотип РР. У тварин ВАТ «Маки» переважав генотип РР (0,8), не було знайдено тварин гомозиготних за дикою алеллю М, частоти алелей М і Р були 0,47 і 0,53 відповідно. Це свідчить про селекційну роботу в господарстві, спрямовану на відбір тварин, що характеризуються інтенсивним приростом живої маси. Морфометричні показники на прикладі живої маси свиней з різними генотипами за геном MC4R ілюструють вірогідні відмінності між тваринами з різними генотипами (табл. 7).
Жива маса свиней (кг) з різними генотипами за геном MC4R, M±m
Господарство Генотипи тварин n MM n PM n PP
Жива маса, кг Жива маса, кг Жива маса, кг
ВАТ «Маки» 0 - 7 144,4±4,01*** 13 164,5±6,03***
СП ТОВ «Нива Переяславщини» 9 248,2±5,42 9 242,1±5,34 6 249,4±8,18
Порівняння результатів сумарного аналізу генотипів породи велика біла у чотирьох господарствах України з результатами інших дослідників (R.D. Houston, N.D. Cameron, K.A. Rance, 2004; J. Chen et al., 2004) свідчать про те, що розподіл генотипів за геном МС4R співпадає з таким розподілом в Англії і Китаї. Оскільки порода велика біла належить до універсальної породи, відмінності у частотах мутантної алелі в різних популяціях можуть свідчити про різні напрямки їх селекції.
Методика ПЛР-експрес аналізу свиней за генами естроген - та меланокортин-4-рецепторів
У результаті проведеної роботи була розроблена експрес тест-система для генотипування свиней за генами ESR та MC4R одночасно, методом ПЛР-ПДРФ, за рахунок оптимізації режиму ампліфікації для обох генів, знижуючи витрати реактивів та час проведення реакцій. При цьому використовували наступний режим ампліфікацій для двох генів: Параметри ампліфікації
Ампліфікатор з активним регулюванням температури (за обємом рідини в пробірці - 25 мкл)
Етапи ампліфікації Температура Час Кількість циклів початкова денатурація ДНК 95 0С 1 хв 1 денатурація 940С 20 с 35 відпал праймерів 600С 20 с синтез 720С 20 с фінальний синтез 720С 5 хв 1
40С Зберігання
Послідовності праймерів
Локус Послідовність
ESR F: 5`-CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3`
R: 5`-CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3`
MC4R F: 5`-TACCCTGACCATCTTGATTG-3"
R: 5`-ATAGCAACAGATGATCTCTTTG-3"
Для рестриктазного гідролізу ампліфікованих фрагментів використовують ферменти рестрикції PVU II, для гену ESR та Taq I для гену MC4R.
Під час ДНК-ідентифікації свиней за геном ESR після обробки рестриктазою Pvu II генотип АА дає фрагмент розміром 120 п.н, АВ-120 п.н. і 55 п.н., а генотип ВВ - 55 п.н. відповідно (Рис. 8).Під час ДНК-ідентифікації свиней за геном MC4R після обробки рестриктазою Taq I генотип ММ характеризується наявністю продуктів розмірами 156 п.н. і 70 п.н., РМ - 226, 156 і 70, РР - 226 п.н. відповідно.
Дослідження свиней за цитогенетичними показниками
Для проведення цитогенетичних досліджень нами було оптимізовано методику приготування препаратів. У тварин забір крові здійснювали як з синуса ока, так із вушної і хвостових вен. Аналіз цитогенетичних препаратів виявив, що більш успішним для культивування лімфоцитів є взяття у свиней крові з синуса ока. Це можна пояснити більшою стерильністю процедури взяття крові з синусу, яка виключає контакт зі шкірою тварин. До недоліків цього методу можна віднести необхідність високого рівня професіоналізму ветеринара, який відбирає зразки крові. Каріотипування не виявило тварин-носіїв геномних та хромосомних мутацій.
Мікроядрений аналіз при цитогенетичних дослідженнях свиней до цього часу не набув широкого застосування, тому параметри умовного контролю за кількістю клітин з мікроядрами для S. scrofa досі невідомі. Для інших ссавців цей показник варіює - 2,7-5,6 ‰ (С.О. Костенко, 2001). Для порівняння отриманих цитогенетичних показників свиней, були взяті цитогенетичні показники мясного типу великої білої породи, які належать ДДАУ ТОВ «Луговське» Дніпропетровського області Солонянського району, с. Александропіль (С.О. Костенко, О.М. Коновал, О.В. Сидоренко, Д.Т. Сметанін, 2009) (табл. 10). Встановлено, що для свиней, які відтворюються в с. Александропіль Солонянського району Дніпропетровської області характерна вірогідно нижча (***Р>0,999) кількість клітин з мікроядрами в порівнянні з тваринами, яких утримують в Київській і Черкаській областях.
Цитогенетичні показники S. scrofa великої білої породи
Господарство Кількість клітин на 1000
МЯ±m ДЯ±m МІ±m
СВК «Розсішське», с. Розсішки (n=7) 1,3±0,31 4,2±0,33 5,1±0,21
ВАТ «Антонов», с. Круглик (n=11) 4,2±0,12 3,1±0,51 9,3±0,61
ВАТ «Маки» (n=6) 4,1±0,43 5,2±0,32 8,2±0,13
Всього (n=38) 3,08±0,181*** 3,87±0,114 7,95±0,252***
Селекція ДДАУ (мясний тип великої білої породи) (n=12) 0,58±0,232*** 3,33±0,933 2,08±0,712***
Менша кількість хромосомних аберацій і анеуплоїдій, наслідком яких є збільшення кількості лімфоцитів з мікроядром, може бути особливістю генотипів тварин дослідженої популяції, обумовленою високими антиоксидантними властивостями організмів. Подібні відмінності відомі для інших видів тварин, зокрема лінійно специфічний рівень хромосомних аберацій та мікроядер у Mus musculus domesticus (О.А. Ковалева та ін., 2007). Не можна виключати впливу в Київській області іонізуючого опромінення, яке збільшує темпи клітинного поділу.
Отримані нами дані свідчать про те, що розмах середніх величин числа лімфоцитів з мікроядрами у свиней, які утримуються в різних господарствах, відповідає показникам умовного контролю (середнім значенням для ссавців).