Інактивування усіх чотирьох генів глікозилтрансфераз, які входять в кластер біосинтезу ландоміцину А. Вплив руйнування гена lanZ2 на спектр утворених ландоміцинів. Аналіз можливості зміни сайту їх глікозилювання шляхом гетерологічної експресії генів.
Аннотация к работе
У порівнянні з іншими ландоміцинами він має найвищу протипухлинну активність, яка поступово зростає із збільшенням кількості цукрових залишків і втрачається при відсутності глікозильної частини. Кластер генів біосинтезу ландоміцину А секвеновано, однак донедавна їх вивчення було утруднене відсутністю ефективної методики внесення екзогенної ДНК в цей штам [Trefzer et al., 2001]. Робота виконувалась у науково-дослідній лабораторії при кафедрі технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології Національного університету «Львівська політехніка» в рамках науково-дослідних тем ДБ «Хінон» (№ держреєстрації 0104V002315) та ДБ «Скринінг» (№ держреєстрації 0102V001199) у 2003-2006 рр. та у науково-дослідній лабораторії при кафедрі генетики та біотехнології Львівського Національного університету ім.І. Франка. Метою нашої роботи було: 1) встановлення особливостей генетичного контролю біосинтезу сахаридної частини ландоміцину А шляхом інактивування генів глікозилтрансфераз і 2) глікозилювання синтетичних біологічно активних сполук за допомогою біотрансформації штамами актиноміцетів. показати можливість зміни сайту глікозилювання ландоміцинів шляхом гетерологічної експресії генів глікозилтрансфераз з інших штамів продуцентів;Точне визначення функції LANGT2 гену проводилося шляхом його інактивації в геномі продуцента завдяки гомологічній рекомбінації між плазмідою PKC-LANGT2-AADA, яка містить касету спектиноміцин-резистентності (AADA) всередині LANGT2 гену, і хромосомним алелем цього гену в S.cyanogenus S136. Щоб створити одиночний мутант з порушеною експресією лише LANGT2-гена, отриманий рекомбінант S.CYANOGENUSДLANGT2 комплементували плазмідою PUWLORIT-LANGT1-LANX, у якій гени LANX і LANGT1 експресуються з конститутивного промотора гену ERME. Подальший аналіз екстрактів штаму методом ВЕРХ МС показав, що пікові з RT 25 хв відповідає сполука з масою 304 Да, яка є меншою за аглікон молекул ландоміцинів (М =338). Тобто продукт гену LANGT2 відповідає за приєднання першого цукру (D-олівози) до 8-O положення ландоміцинового аглікону під час біосинтезу ландоміцину А. Щоб підтвердити функцію L-родинозилтрансферази LANGT4, ми проводили два види комплементації даного мутанта: 1) Повністю комплементований мутант S.cynogenus POJДGT3, в якому відбулася експресія усіх шести генів (LANGT3, LANZ2, LANZ3, LANGT4, LANZ4 i LANZ5 - плазміди PKC1218ERMGT3-4 і PUWLORITZ4Z5) продукував повний спект сполук, характерних для дикого типу (ландоміцини B, D і A).В результаті виконаної роботи зясовано функції пяти структурних lan-генів в штамі S. cyanogenus S136. Інактивація гену LANGT2 призводить до продукції рекомбінантним штамом нового ангуцикліну - тетрангулолу. Ген LANGT2 кодує олівозилтрансферазу, що приєднує перший залишок D-олівози під час синтезу ландоміцину А. Ген LANGT3 кодує олівозилтрансферазу, що приєднує третій залишок D-олівози під час синтезу ландоміцину А. Інактивація гену LANZ2 призводить до зміни спектру ландоміцинів, які продукуються рекомбінантним штамом.
План
Основний зміст
Вывод
В результаті виконаної роботи зясовано функції пяти структурних lan-генів в штамі S. cyanogenus S136. Вперше отримано нові ландоміцини із зміненою структурою та типом приєднання сахаридної частини молекули. Виявлено, що актиноміцетний штам Saccharotrix espaniensis здатний глікозилювати широкий спектр антрахінонів.
1. Інактивація гену LANGT2 призводить до продукції рекомбінантним штамом нового ангуцикліну - тетрангулолу. Ген LANGT2 кодує олівозилтрансферазу, що приєднує перший залишок D-олівози під час синтезу ландоміцину А. Глікозилювання передує гідроксилюванню положеннях C-6 та C-11 ландоміцинону.
2. Мутантні штами S. cyanogenus з інактиваними генами LANGT1, LANGT3 і LANGT4 продукують нові ландоміцини J, E та D, відповідно. Ген LANGT3 кодує олівозилтрансферазу, що приєднує третій залишок D-олівози під час синтезу ландоміцину А. Ген LANGT4 кодує родинозилтрансферазу.
3. Глікозилтрансфераза LANGT1 приєднує другий і пятий цукри, а LANGT4 каталізує приєднання третього і шостого цукрів під час біоситезу гексасахаридного ланцюга ландоміцину А. Це вперше описані антибіотичні ГТ, які функціонують двічі під час біосинтезу глікозидної частини антибіотика.
4. Інактивація гену LANZ2 призводить до зміни спектру ландоміцинів, які продукуються рекомбінантним штамом. LANZ2 бере участь в підтриманні правильного співвідношення ТДФ-активованих дезоксицукрів.
5. Експресія гену URDGT2 в мутанті S. cyanogenus ДLANGT2 призводить до продукції нових С-глікозильованих тетрангулолів. Глікозилтрансфераза URDGT2 має широку субстратну специфічність.
6. Штам Saccharotrix espaniensis здатний модифікувати широкий спектр антрахінонів (алізарин, емодін, 1-аміно-4-хлороантрахінон, 1-аміно-4-гідроксиантрахінон) шляхом приєднання дезоксицукру L - рамнози.
Перелік наукових праць, опублікованих за матеріалами дисертації
1. Fedoryshyn M., Luzhetskyy A., Dьrr C., Taguchi T., Novikov V., Bechthold A. Iteratively acting of glycosyltransferases involved in the hexasaccharide biosynthesis of landomycin A. // CHEMBIOL. - 2005.-Vol.12. - N11. - P.918-929.
Особистий внесок: одержання рекомбінантних штамів S.cyanogenus S136 з інактивованими генами глікозилтрансфераз, проведення фізико-хімічних аналізів продуктів мутантів, інтерпретація отриманих результатів.
Особистий внесок: конструювання рекомбінантної плазміди PSETOLI, її внесення у штам S.fradiae шляхом конюгації, участь в обробці результатів.
3. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V. Gene cloning system for Streptomyces cyanogenus S136 // Вісн. Львів. Унів. - 2002. - Vol.29. - P.62-68.
Особистий внесок: підбір параметрів для здійснення міжродового конюгантивного схрещування.
4. Luzhetskyy A., Liu T., Fedoryshyn M., Ostash B., Fedorenko V., Rohr J., Bechthold A. Function of LANGT3, a glycosyltransferase gene involved in landomycin A biosynthesis. // Chembiochem. -2004. - Vol.5. - N11. - P.1567-1570.
Особистий внесок: створення рекомбінантної плазміди PKC LANGT3.
5. Luzhetskyy A., Zhu L., Gibson M., Fedoryshyn M., Dьrr C., Hofmann C., Hoffmeister D., Ostash B., Mattingly C., Adams V., Fedorenko V., Rohr J., Bechthold A. Generation of Novel Landomycins M and O Through Targeted Gene Disruption. //CHEMBIOCHEM. -2005.-Vol.4. - P.675-678.
Особистий внесок: конструювання рекомбінантних плазмід PKCLANZ4Z5, та PUWLORITZ4Z5 та їх внесення у штам S.cyanogenus S136 шляхом конюгації, участь в обробці результатів біологічної активності синтезованих речовин, формулювання висновків.
6. Luzhetskyy A., Taguchi T., Fedoryshyn M., Dьrr C., Wohlert SE., Novikov V., Bechthold A. LANGT2 catalyzes the first glycosylation step during landomycin A biosynthesis. // Chembiochem. -2005. - Vol.6. - N8. - P.1406-10.
Особистий внесок: одержання рекомбінантного штаму S.cyanogenus S136ДLANGT2, проведення фізико-хімічних аналізів продуктів мутантів, інтерпретація отриманих результатів.
7. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Gromyko O., Ostash B., Rebets Y., Bechthold A., Fedorenko V. INCP Plasmids are most effwective in mediating conjugation between Escherichia coli and Streptomycetes // Rus. J. of Gen. -2006.-Vol.42.-N5. - P.476-481.
Особистий внесок здобувача: участь у конструюванні плазмід, опрацювання літератури.
8. Fedoryshyn M.Y., Luzhetskyy A.M. Obtaining of recombinant strains of Streptomyces galilaeus - producer of aclacinomycins. // Конференція для студентів, аспірантів і молодих науковців з молекулярної біології та генетики, 20-22 вересня, 2001, Київ, Україна. Збірник тез. С. 90.
9. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V.; Conjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to Streptomyces kanamyceticus: Effects of chromosomal insertions on kanamycin production. // «Biologie bakterieller Naturstoffproduzenten» Фрайбург, ФРН, 29 вересня - 1 жовтня, 2002, V3.
10. Luzhetskyy A., Lyabah N., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V. Heterologous expression of landomycin biosynthesis genes in S. fradiae Ть2717-producer of urdamycines. // Перша Українська конференція молодих науковців. 10-11 лютого 2003, Київ, Україна. Збірник тез. С. 128-129.
11. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Taguchi T., Duerr C., Novikov V., Bechthold A. Unusual pathway of hexasaccharide biosynthesis in landomycin A molecule. // International Symposium in Jena «Biology of Bacteria producing Natural Products» 26-28 вересня, 2004, Р24.
12. Fedoryshyn M., Luzhetskyy A., Dьrr C., Hofmann C., Hoffmeister D., Novikov V., Rohr J., Bechthold A. Characterisation of genes encoding the reductase LANZ4 and the oxygenase LANZ5. // International Symposium in Jena «Biology of Bacteria producing Natural Products» (ФРН). 26-28 вересня, 2004, Р16.
13. Федоришин М., Лужецький А., Бехтольд А., Новіков В. Створення мутантних штамів Streptomyces cyanogenus S136, які продукують нові глікозильовані сполуки. // ІІ Всеукраїнська науково-практична конференція «Біотехнологія. Освіта. Наука.» Львів, Україна, 6-8 жовтня 2004. Збірник тез С. 94.
14. Лужецький А., Грек М., Федоришин М., Осташ Б., Басілія Л., Бехтольд А., Федоренко В. Використання конюгації для створення рекомбінантних штамів Streptomyces cyanogenus S136 // І Всеукраїнська науково-практична конференція студентів, аспірантів та молодих учених. 10-11 лютого 2003 р., м. Київ, Україна. Збірник тез С. 127-128.
15. Taguchi T., Fedoryshyn M., Luzhetskyy A., Ichinose K., Bechthold A. Purification and structure elucidation of the novel glycosylated compounds produced by the mutant of landomycin producer, Streptomyces cyanogenus S136. // 10th International symposium on the genetics of industrial microorganisms. 24-28 червня 2006 р. м. Прага, Чешська республіка. Збірник тез С. 243-244.