Морфоцитогенетичні методи розробки елементів комплексного аналізу раннього ембріогенезу. Використання епідидимальних сперматозоїдів у системі біотехнологічної селекції програм збереження біорізноманіття. Вплив цитоплазматичної краплини кнурів in vitro.
Аннотация к работе
Метою досліджень було розробити на основі морфоцитогенетичних методів елементи комплексного аналізу раннього ембріогенезу великої рогатої худоби і свиней з використанням епідидимальних сперматозоїдів у системі біотехнологічної селекції та програмах збереження біорізноманіття. встановити вплив цитоплазматичної краплини епідидимальних сперматозоїдів кнурів на розвиток ембріонів свиней in vitro; дослідити закономірності формування ембріонів великої рогатої худоби in vitro в разі використання епідидимальних сперматозоїдів бугаїв для запліднення яйцеклітин; Встановлено вплив надшвидкого заморожування ембріонів великої рогатої худоби на їх життєздатність в умовах розвитку in vitro. епідидимальний сперматозоїд ембріогенез селекція Детальну цитогенетичну оцінку розвитку in vitro ембріонів після надшвидкого заморожування розроблено для використання у практиці трансплантації ембріонів.Для розробки комплексної оцінки епідидимальних сперматозоїдів бугаїв і кнурів опрацьовано підходи щодо їх кріоконсервування та перевірена їх запліднювальна здатність під час одержання ембріонів поза організмом. Одержано нові наукові дані щодо генетичних аспектів гаметогенезу ссавців за комплексної характеристики епідидимальних сперматозоїдів бугаїв і кнурів. Узагальнено роль методів ембріологічної генетики, які ґрунтувались на вивченні реалізації генетичної інформації під час формування ембріонів великої рогатої худоби і свиней in vitro і аналізі цитогенетичних характеристик їх розвитку. За результатами цитогенетичного аналізу встановлено, що рівень формування зигот свиней in vitro є подібним коли для осіменіння поза організмом яйцеклітин використовували епідидимальні сперматозоїди, які були заморожені в середовищі «ЛГЖ» і «Біоконсан» (51,9 % і 55,2 %, відповідно). Шляхом комплексного морфо-та цитогенетичного аналізу ефективності розвитку ембріонів свиней in vitro з використанням епідидимальних сперматозоїдів кнурів різного віку встановлена тенденція, що середовище «Біоконсан» і «ЛГЖ» для їх заморожування забезпечують високий рівень формування зигот (61,2 % для 2-річного плідника та 56,1 % для 4-річного і 49,2 % для 2-річного плідника та 45,7 % для 4-річного, відповідно).
Вывод
1. Для розробки комплексної оцінки епідидимальних сперматозоїдів бугаїв і кнурів опрацьовано підходи щодо їх кріоконсервування та перевірена їх запліднювальна здатність під час одержання ембріонів поза організмом. Одержано нові наукові дані щодо генетичних аспектів гаметогенезу ссавців за комплексної характеристики епідидимальних сперматозоїдів бугаїв і кнурів. Узагальнено роль методів ембріологічної генетики, які ґрунтувались на вивченні реалізації генетичної інформації під час формування ембріонів великої рогатої худоби і свиней in vitro і аналізі цитогенетичних характеристик їх розвитку.
2. Встановлено, що гіпобіотичний стан та збереження цілісності акросоми епідидимальним сперматозоїдам кнурів забезпечує середовище «Androstar» і температура 4?С. Такі умови дозволяють запобігти деструктивним змінам гамет і забезпечити їх виживаність не менше 10 діб із середнім значенням активності 3,5 бали.
3. Цитогенетичним контролем розвитку ембріонів свиней in vitro виявлено, що наявність залишку сперматидної цитоплазми на хвостиках епідидимальних сперматозоїдах кнурів не має негативного впливу на формування зародків поза організмом. Такі сперматозоїди забезпечують запліднювальну здатність яйцеклітин на рівні 58,5 %, одержання роздроблених ембріонів не нижче 42 %.
4. За результатами цитогенетичного аналізу встановлено, що рівень формування зигот свиней in vitro є подібним коли для осіменіння поза організмом яйцеклітин використовували епідидимальні сперматозоїди, які були заморожені в середовищі «ЛГЖ» і «Біоконсан» (51,9 % і 55,2 %, відповідно). Відсоток розвитку придатних для імплантації зародків суттєво не відрізнявся (16,6 % і 21,0 % для «ЛГЖ» і «Біоконсан», відповідно).
5. Шляхом комплексного морфо- та цитогенетичного аналізу ефективності розвитку ембріонів свиней in vitro з використанням епідидимальних сперматозоїдів кнурів різного віку встановлена тенденція, що середовище «Біоконсан» і «ЛГЖ» для їх заморожування забезпечують високий рівень формування зигот (61,2 % для 2-річного плідника та 56,1 % для 4-річного і 49,2 % для 2-річного плідника та 45,7 % для 4-річного, відповідно).
6. Доведено, що із збільшенням віку кнурів-донорів епідидимальних сперматозоїдів (1,5; 2; 3,5; 4 роки) закономірно зростає результативність формування in vitro ембріонів свиней (9,7 %; 15,8 %; 19,4 %; 23,5 %). Відсутність вірогідної різниці між показниками свідчить про ефективне використання гамет, вилучених із хвостових частин придатків сімяників кнурів різних вікових груп, у біотехнологічних дослідженнях на основі генетики розвитку та як метод збереження генофонду тварин.
7. Розроблено комплексний підхід досліджень епідидимальних сперматозоїдів бугаїв на основі якого встановлено, що гамети самців, які не використовувались як плідники, проявляють активність на рівні 6 - 7 балів лише у 1/3 досліджуваних тварин. Встановлено, що транспортування епідидимісів разом із сімяниками забезпечує активність сперматозоїдів від 3 до 6 балів у 55,6 % досліджуваних тварин, а в разі відокремлення придатка сімяника подібна активність гамет виявлена лише у 25 %.
8. За результатами цитогенетичного аналізу встановлено, що використання свіжовилучених епідидимальних сперматозоїдів бугаїв для осіменіння in vitro яйцеклітин забезпечує вищий рівень формування зигот (85,9 %), порівняно із кріоконсервованими (64,3 %, Р < 0,01). Це забезпечує більш ефективний розвиток поза організмом утворених ембріонів, що проявлялось суттєво вищим рівнем дроблення зародків (76,6 % проти 60,8 %, відповідно, Р < 0,05) та формуванням ембріонів (25,0 % проти 12,0 %, відповідно, Р < 0,05).
9. Шляхом детального цитогенетичного аналізу вилучених від корів-донорів ембріонів, які піддавали надшвидкому заморожуванню, оцінено їх життєздатність за станом ядер. Встановлено, що прояв ембріонами повноцінних морфологічних характеристик після їх розморожування відповідає цитогенетичній оцінці ядер на стадії інтерфази мітозу.
ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ
1. Для підвищення рівня використання генетичного потенціалу сільськогосподарських тварин застосовувати метод кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів. Враховуючи вивчені закономірності сперматогенезу епідидимальних гамет застосовувати їх у селекційному процесі та для збереження генофонду неконкурентоспроможних племінних ресурсів.
2. На основі методики надшвидкого заморожування ембріонів великої рогатої худоби впровадити в практику трансплантації детальну цитогенетичну оцінку зародків у програмах збереження генофонду тварин.
3. Враховуючи генетичний механізм раннього ембріогенезу великої рогатої худоби і свиней під час розвитку зародків in vitro застосовувати цей метод для аналізу спермопродукції плідників.
Список литературы
1. Щербак О. В. Використання методу вітрифікації при заморожуванні ембріонів великої рогатої худоби / О. В. Щербак // Вісн. аграр. науки. - 2005. - № 2. - С. 77-78.
2. Куновський Ю. В. Отримання зародків свиней in vitro з використанням гамет самиць різного віку / Ю. В. Куновський, О. В. Щербак // Вісн. аграр. науки. - 2006. - № 6. - С. 78-79. (Дисертантом заплановані дослідження, виконана експериментальна частина роботи, підготовлено текст статті до друку).
3. Ковтун С. И. Использование эпидидимальных сперматозоидов для сохранения генофонда / С. И. Ковтун, О. Д. Бирюкова, О. В. Щербак // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології : Зб. наук. пр. - К. : ЛОГОС, 2007. - Т. 1. - С. 249-252. (Дисертантом зібраний і проаналізований експериментальний матеріал).
4. Щербак О. В. Епідидимальні сперматозоїди кнурів та ефективність ембріогенезу свиней in vitro / О. В. Щербак // Наук. - техн. бюл. / УААН, Ін-т тваринництва. - Х., 2008. - № 96. - С. 469-472.
5. Щербак О. В. Морфологічна оцінка епідидимальних сперматозоїдів бугаїв / О. В. Щербак // Вісник аграрної науки. - 2008. - № 6. - С. 81-82.
6. Щербак О. В. Біотехнологічні методи одержання і зберігання гамет сільськогосподарських тварин / О. В. Щербак, П. А. Троцький, А. Б. Зюзюн // Фактори експериментальної еволюції організмів : Зб. наук. пр. - 2008. Т. 5. - С. 463-467. (Дисертантом узагальнено матеріали досліджень, сформульовано висновки, підготувала текст статті).
7. Пат. 33658 Україна, МПК А 61D 19/02. Спосіб кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів / Ковтун С. І., Щербак О. В., Мелешко Н. Я.; заявник і патентовласник Ін-т розведення і генетики тварин УААН. - u 2008 00502; заявл. 15.01.08; опубл. 10.07.08, Бюл. № 13. (Дисертант виконала експериментальну частину, сформулювала висновки).
8. Щербак О. В. Кріоконсервування ембріонів великої рогатої худоби методом вітрифікації // Матеріали конф. молодих вчених та аспірантів / О. В. Щербак // Ін-т розведення і генетики тварин УААН. - Чубинське, 2004. - С. 53-54.
9. Щербак О. В. Нові підходи при кріоконсервуванні гамет сільськогосподарських тварин / О. В. Щербак // Конференція молодих вчених та аспірантів / Ін-т розведення і генетики тварин УААН. - с. Чубинське, 2005. - С. 71-73.
10. Ковтун С. І. Методика отримання, короткотривалого зберігання і кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів бугаїв та кнурів / С. І. Ковтун, Н. Я. Мелешко, О. В. Щербак // Методики наукових досліджень із селекції, генетики та біотехнології у тваринництві : наук. зб. - К., 2005. - С. 200-204. (Дисертант приймала участь у розробці методики отримання і кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів бугаїв та кнурів, готувала текст до друку).
11. Ковтун С. І. Заморожування методом вітрифікації ембріонів великої рогатої худоби, отриманих in vivo та in vitro / С. І. Ковтун, О. В. Щербак // Методики наукових досліджень із селекції, генетики та біотехнології у тваринництві : наук. зб. - К., 2005. - С. 204-209. (Дисертантом висвітлені теоретичні і методичні аспекти вітрифікації ембріонів великої рогатої худоби).
12. Щербак О. В. Дослідження епідидимальних сперматозоїдів бугаїв // Матеріали IV конф. молодих вчених та аспірантів / О. В. Щербак // Ін-т розведення і генетики тварин УААН. - с. Чубинське, 2006. - С. 93-94.
13. Nanocomposites in biotechnology for prolonged preservation of gene pool (synthesis and application) / N. P. Galagan, I.V. Siora, S. I. Kovtun, O. V. Scherbak // ХІ Polish - Ukrainian Symposium «Theoretical and experimental studies of interfacial phenomena and their technological applications», August 22 - 26, 2007. - Krasnobrod - Zamosc, 2007. - P. 27. (Дисертант приймала участь у проведенні експериментів, узагальненні одержаних результатів).
14. Щербак О. В. Епідидимальні сперматозоїди кнурів і формування ембріонів in vitro // Матеріали VI конф. молодих вчених та аспірантів / О. В. Щербак // Ін-т розвед. і генет. тварин УААН. - с. Чубинське, 2008. - С. 99-100.
15. Щербак О. В. Вплив температури на гіпобіотичний стан епідидимальних сперматозоїдів кнурів // Тези міжнародної наукової конференції, що була проведена на базі кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М. Ф. Гулого Національного аграрного університету «Гіпобіоз - фундаментальні та прикладні аспекти». - К., 2008. - С. 35-36.