Порівняльна характеристика клінічних проявів порушень бронхолегеневої системи і системи травлення залежно від генотипу у дітей хворих на муковісцидоз у віці від 1 місяця до 15 років. Оптимізація схеми генетичного консультування та допологової діагностики.
Аннотация к работе
Муковісцидоз (МВ) - аутосомно-рецесивне спадкове захворювання, яке зумовлено мутацією гена трансмембранного регуляторного білка та характеризується ураженням екзокринних залоз життєво важливих органів, ранньою маніфестацією, тяжким перебігом і високою летальністю. Це захворювання слід розглядати як багатогранну клінічну проблему, що привертає увагу педіатрів, генетиків і фахівців молекулярної біології. На сьогодні виявлено понад 750 мутацій цього гена [ECCACF, 1997], але найпоширенішою в більшості обстежених популяцій є “мажорна” мутація DELF508 [B.Kerem et al,1989; L.Tsui,1995]. Розвязання цих питань в Україні дозволять удосконалити ранню діагностику МВ і значно поліпшити своєчасне адекватне лікування, активне диспансерне спостереження хворих дітей, а також генетичне консультування з наступним проведенням допологової діагностики в інформативних родинах. Оцінити фенотипові прояви змін бронхолегеневої системи і системи травлення у дітей, що страждають на МВ, залежно від генотипу - з метою поліпшення пре-і постнатальної діагностики цього захворювання; оптимізувати схему генетичного консультування на основі вивчення частот найбільш поширених мутацій гена ТРБМ в Україні.
Список литературы
По темі дисертації опубліковано 11 робіт. У тому числі 4 журнальні статті (Журнал практического врача, 1997; Педіатрія, акушерство та гінекологія, 1998, 1999; ECCACF Newsletter, 1996).
Обсяг та структура роботи
Дисертаційна робота, викладена на 150 сторінках машинопису, складається із вступу, огляду літератури, 4 розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення власних досліджень, висновків, списку використаних джерел. Текст дисертації ілюстровано 25 таблицями та рисунками. Список використаних джерел містить 183 назви.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ муковісцидоз допологовий генетичний діагностика
Обєкт та методи дослідження
Для розвязання поставлених завдань нами було обстежено 111 дітей, хворих на муковісцидоз, віком од 3 місяців до 15 років із 100 родин.
Розподіл за статтю і віком: хлопчиків - 62, що становило 56%, а дівчаток - 49 - 44% відповідно. Дітей до 1 року - 57 (51,4%), у віці 1-3 роки - (18%), 4-7 років - 23 (20,7%), 8-12 років - 9 (8,1%), після 14 років - 2 (11,8%). За етнічним складом спостережуваних родин пацієнти розподілялися у такий спосіб: 86 (77.4%) - українці, 5 (4,5%) - росіяни, 2 (1,8%) - молдавани, а 18 дітей - від змішаних шлюбів між українцями і росіянами.
Усіх хворих було піддано комплексному клінічному, лабораторному і функціональному обстеженню, що включало низку спеціальних методів - ДНК-аналіз, аналіз хлоридів потової рідини, рентгенологічне обстеження органів грудної клітини; електрокардіографію, ехокардіографію, спірографию, УЗД- діагностику органів черевної порожнини, дослідження парциальної напруги кисню в крові. Оцінку ступеня тяжкості захворювання проводили за шкалою Швахмана-Брасфилда, згідно з модифікацією В.Рачинського і М.Капранова [1985].
Молекулярно-генетичні дослідження, якими було охоплено хворих дітей, їхніх батьків і сибсів, здійснила група молекулярної діагностики спадкових хвороб інституту Молекулярної біології і генетики АН України (керівник групи кандидат біологічних наук Л.А. Лівшиць). ДНК-аналіз включав визначення семи мутацій у 7, 10, 11 екзонах гена ТРБМ: DELF508, 1677 DELTA (10 екзон), R553X, G551D (11 екзон), R334W,1154INSTC, del5491 (7 екзон), а також сімейний аналіз поліморфних ДНК - маркерів, щільно зчеплених із геном МВ у системах (KM-19/Pstl XV2C TGG1 і J3. 11Pst). Ідентифікація мутацій здійснювалася за допомогою полімеразної ланцюгової реакції синтезу ДНК (ПЦР) [J.Kenneth et al,1990], із наступною ідентифікацією наявності або відсутності відповідних мутацій за допомогою електрофорезу. Специфічність ПЦР визначалася парою олігопраймерів, комплементарних кінцям фланкуючих ділянок ампліфікації. ПЦР проводили на термоциклері "Perkin Elmer" (фірма "Cetus", США) за схемою, запропонованою Salki [R.K. Saiki et al,1988]. За результатами ДНК-аналізу в 57,2% випадків виявлено такі мутації гена ТРБМ: DELF508 - 56,3%; R553X - 0,45%; G551D - 0,45%, і хворих дітей було поділено на три генотипові групи: перша - із генотипом DELF508/DELF508, друга - DELF508/x і третя - x/x.
Діагноз підтверджувався підвищеною концентрацією хлоридів поту, що становила в середньому по групі 96,38 3,87 ммоль/л. Визначення концентрації електролітів у поті виконувалося за допомогою пілокарпінового електрофорезу за методом Гібсона і Кука, [L.Gibson, R.E Cooke,1959]. Підвищення концентрації хлоридів потової рідини відзначалося у всіх генотипових групах (таблиця 1).
Вік, у якому вперше діагностувався муковісцидоз, коливався від 1 місяця до 14 років і по групі в середньому становив 19,15 3,18 місяця.
Таблиця 1. Середні величини концентрації електролітів поту (ммоль/л) у дітей, хворих на муковісцидоз, залежно від тяжкості захворювання і генотипу
Групи за генотипом Задовільний перебіг Середньо- тяжкий перебіг Тяжкий перебіг Середнє значення електроліту
Більшість спостережуваних дітей потрапили до клініки в період загострення бронхолегеневого процесу (їх обстежували тільки упродовж цього періоду).
За даними клініко-генеалогичного анамнезу, усі хворі діти були народжені від здорових батьків. Середній вік батьків до моменту пологів: мати - 24,7 років, батько - 26.5 років.
У досліджуваних хворих дітей перші ознаки захворювання виявлялися: від народження - у 53 дітей (47,7%); у віці до 3-х місяців - у 33 (29,7%), до одного року - у 20 (18%). Таким чином, у більшості дітей (106 хворих, 95%) перші клінічні ознаки захворювання розвивалися вже на першому році життя.
Відповідно до даних клінічної картини й обєктивного дослідження, змішана форма муковісцидоза спостерігалася у 88 дітей (79,3%); у 8 випадках (7,2%) - легенева форма, у 15 випадках (13,5% %) - кишкова форма (таблиця 2).
Таблиця 2. Розподіл хворих на муковісцидоз за формою захворювання залежно від генотипу
Форма del508/DELF508 del F508/ x x / x Усього захворювання кільк. % кільк. % кільк % кільк.
Змішана 38 86,4 30 81,1 20 66,6 88 79,3
Легенева - - 3 8,1 5 16,7 8 7,2
Кишкова 6 13,6 4 10,8 5 16,7 15 13,5
Усього 44 39,6 37 33,4 30 27,0 111
Зміни у стані бронхолегеневої системи на першому році життя постали у 88% дітей. Середній вік прояву респіраторного синдрому становив 5,3 місяця. У 22 із цих дітей (23,4%) респіраторний синдром постав до першого місяця життя. Першими його проявами було легке покахикування (без або на фоні респіраторної вірусної інфекції) із поступовим розгортанням характерних клінічних проявів хвороби: затяжний або постійний приступоподібний кашель з глевкою, гнійною важко відхаркуваною мокротою, вологі хрипи в легенях, що зберігаються після ліквідації гострих явищ.
Середній вік прояву кишкового синдрому становив 2,1 0,3 місяця. У 38 випадках (37%) кишковий синдром розпочався від народження. У 16 дітей (14,4%) захворювання маніфестувало меконієвим ілеусом.
З-поміж ускладнень захворювання диагностовано: спонтанний пневмоторакс (3,6%), ателектаз (5,4%), серцево-легенева недостатність із розвитком легеневого серця (26,1%) і його декомпенсацією (4,4%), біліарний цироз печінки (2,7%). У періоді спостереження у 6,7% відзначалися ознаки гострого синусита, 3,3% дітей мали полипоз носових ходів, 5,6% - аденоїди II і III ступеня.
Для комплексної оцінки фізичного розвитку використовували як перцентільні стандарти, так і масо-зростовий індекс (МЗІ), розроблені I.M. Tanner, що дозволяе оцінити показники маси тіла у звязку з ростом (нормою вважається МЗІ від 110 до 90 відсотків) [Мазурін А.В. і ін.,1985; I.M. Tanner et al, 1966].
Масо-зростовий індекс розраховується у такий спосіб: {(фактична вага)/(ідеальна вага відповідно до зросту і статі)} х 100%.
Відставання у фізичному розвитку було виявлено у 87 (78,4%) дітей стосовно ваги й у 72 (64,8%) стосовно зросту (масо-зростові показники нижчі за 10 перцентилів). При цьому виразні порушення (менш як 3 перцентиля) стосовно ваги виявлено у 58,6% хворих, стосовно зросту - у 37,7%. Середні показники ваги у всієї групі становили 12,72 1,85 перцентилів, зросту - 25,0 3,1 перцентилів. Масо-зростовий індекс був нижчий за норму і дорівнював 84,3% у всієї групи.
Рентгенологічна картина залежала від тривалості хвороби, тяжкості стану і фази захворювання. Найбільш характерною була загальна емфізематозність (68%), а також поєднання дрібнобульозних здуттів із стовщенням стінок бронхів, кільцеподібних і лінійних утворень, кіст (60%) на фоні двостороннього дифузійного легеневого рисунка. Рентгенологічний індекс у середньому по групі дорівнював 12,20 0,64 балам.
Дослідження функції зовнішнього подиху у більшості хворих дітей (14 хворих - 85%) виявило комбіновану форму вентиляційних порушень, а у двох дітей - реструктивну форму. У 28% дітей показники функції зовнішнього подиху були в нормі. Вентиляційну недостатність I-II ступеня було виявлено у трьох хворих, III ступеня - у 4-х дітей, IV ступеня - у 3-х дітей. Аналіз даних електрокардіограми виявив у більшості хворих (86%) порушення метаболічних процесів у міокарді гіпоксичного характеру; було також синусову тахікардію (72,4%), перевантаження правих відділів серця (30,6%). Ехокардіографія виявила у 10 (10,2%) хворих гіпертрофію міокарда правого шлуночка, у 42%) хворих - зниження скоротності міокарда.
Для аналізу даних застосовано метод первинного статистичного упорядкування, дисперсійний, кореляційний, дискримінантний і регресійний методи. Для повного виявлення впливу генотипу на прояви клінічних ознак захворювання ми вдалися до інтегральних показників. Для їхньої оцінки застосовувалася авторська методика М.Ю. Антамонова [М.Антамонов, 1991]. Упорядкування здійснювалося на персональному компютері в пакеті "Statistica" [О.Минцер та ін.,1991; Г.Максимов та ін.,1983; Г.Лакін,1980; М.Антамонов, 1991].
Результати дослідження та їх обговорення
Бронхолегеневі зміни домінують у клінічній картині муковісцидозу, визначають його перебіг і прогноз. З метою вивчення звязку між типом мутації і клінічними варіантами протікання респіраторного процесу нами було вивчено особливості ураження бронхолегеневої системи у дітей залежно від генотипу. У групі гомозигот відзначається рання маніфестація захворювання, у 62% дітей перші ознаки захворювання постали від народження, у третини із них були прояви типового респіраторного синдрому (сухий кашель вранці, приступоподібний, подеколи коклюшоподібний, із важко відокремлюваною глевкою мокротою). У 38% випадків ознаки захворювання зявилися у 6-місячному віці. На першому році життя у 94% дітей розвинувся респіраторний синдром. Середній вік його прояву становить у групі 3,2 0,76 місяця.
Середня величина PAO2 - параметра, який найвиразніше віддзеркалює киснетранспортну функцію організму, дорівнювала 61,1 2,81 мм рт. ст. У цій групі загострення бронхолегеневого процесу були найчастіші й протікали найважче (на зразок пневмонії у 84%). Для рентгенологічної картини були характерні здуття легеневої тканини (гіперінфляція), посилення і деформація бронхосудинного рисунка, осередкові, рідше сегментарні і часткові інфільтрати.
Рентгенологічний індекс за Брасфилдом дорівнював у цій групі 10,5 бала. У 16% дітей бронхолегеневий процес відбувався із втягуванням бронхів різного калібру, на зразок бронхіту.
Таблиця 3. Ступінь дихальної недостатності дітей, хворих на муковісцидоз, залежно від генотипу
Ступінь дихальної недостатності Гомозиготи за DELF508/DELF508 Гетерозиготи за DELF508/ x x / x
ДН 0 ст. - 26,3 4,2
ДН I ст. 12,9 25,0 16,7
ДН II ст. 25,8 34,0 29,1
ДН III ст. 58,0 31,3 50,0
ДН IV ст. 3,3 3,0 -
Як видно з таблиці 3, зіставлення клінічних і функціональних показників у групі DELF508/DELF508 виявило у 2/3 дітей ДН-III ст. (Z=2,69, p<0,007), що свідчить про більш важкий, порівняно з дітьми II групи, перебіг хронічного бронхолегеневого процесу II групи. Діти носії неідентифікованих мутацій посідали проміжне місце - між хворими I і II групи, що підтверджується статистично (p<0,01). У досліджуваних групах хворих важкий перебіг захворювання відзначався в 77,3% (I група), 48,7% (II група), 60% (III група) випадків відповідно (p<0,05). Прогресування хронічного бронхолегеневого процесу в цій групі призводило до ряду ускладнень. Таке грізне ускладнення як пневмоторакс у нашому дослідженні відзначалося в 10% випадків і тільки у дітей цієї групи. Згідно з критеріями, наведеними у літературі, легенево-серцевий синдром (cor pulmonale) було діагностовано у 38% дітей цієї групи [М.І.Капранов і ін., 1995].
Проведений аналіз даних анамнезу, бальної оцінки і параклінічні дослідження показали виразний клінічний поліморфізм змін у бронхолегеневій системі у дітей ІІ групи. Рання маніфестація захворювання від народження спостерігалася дещо рідше (у 35%), у перші шість місяців - у 89%, а до кінця першого року життя - у 100% дітей. Захворювання з однаковою частотою розпочиналося як із респіраторного, так і з кишкового синдрому. У 82% дітей респіраторний синдром розвинувся на першому році життя. Середній вік його прояву становив 3,9 1,3 місяця. Загострення бронхолегеневого процесу з втягуванням паренхіми легенів на зразок пневмонії протікали легше і зустрічалися у 63% дітей, а на зразок бронхіту - у 37%. Величина PAO2 знижувалася до 65,4 1.9 мм рт. ст. Дихальну недостатність III ступеня було виявлено тільки у третини хворих дітей, тоді як у 26% дітей таких змін виявлено не було. Прогресування хронічного бронхолегеневого процесу призвело до формування "cor pulmonale" у 33% дітей цієї групи. Індекс Швахмана, нижчий за 40 балів, відзначено у 49% дітей. Серед носіїв неідентифікованих мутацій прояви захворювання від моменту народження відзначалися у 30% хворих дітей, у 85% випадків його ознаки зявилися до кінця першого року життя, а у 15% - після одного-двох років життя. Захворювання починалося з респіраторного синдрому у 53% хворих. Середній вік початку прояву респіраторного синдрому становить 8,6 1,3 місяця. Загострення на зразок пневмонії відзначені у 68%, на зразок бронхіту - у 32%. Рентгенологічний індекс за Брасфілдом дорівнює 9,1 бала, PAO2 - 63,2 2.8 мм рт. ст. ДН-ІІІ ступеня визначено у 50% дітей. "Cor pulmonale" - у 20%. Індекс Швахмана, нижчий за 40 балів, був у 60% дітей.
Проведені клінічні дослідження і ряд показників, що характеризують ступінь ураження бронхолегеневої системи, - тип загострення (пневмонія), низькі показники РАО2, більш рання поява ознак захворювання, оцінка за шкалою Швахмана, - свідчили про більш важкий клінічний перебіг бронхолегеневого процесу в першій групі (p<0,05). У другій групі відзначався виразний клінічний поліморфізм змін бронхолегеневої системи. У третій групі досліджувані показники посідали проміжне місце між першою і другою групами.
Для оцінки впливу генотипу на клінічний прояв хронічного бронхолегеневого процесу нами було розроблено інтегральний показник, який сполучав тяжкість перебігу захворювання в балах за Швахманом, тип його загострення, ДН, тяжкість перебігу, оцінку рентгенологічного індексу за Брасфилдом. Середнє значення інтегрального показника становило в I, II, та III відповідно - 0,72 0,03; 0,56 0,05; 0,61 0,05; p<0,05). Порівняння здійснювалося за ранговим коефіцієнтом Спирмена, величина якого - ?s=0,19 (p<0,05), що свідчить про наявність асоціації між генотипом і клінічними проявами хронічного бронхолегеневого процесу.
Наші спостереження і дані авторів [L.C.Tsui,1995; L.C.Tsui., P.Durie, 1997; ICFC,1996] про звязок між типом мутації і фенотиповими проявами змін у бронхолегеневій системі відбивають їхню варіабельність в генотипових групах, що вказує на відсутність жорсткого генетичного контролю гена МВ на ступінь тяжкості проявлення порушень функції бронхолегеневої системи.
Для оцінювання звязку впливу генотипу на порушення системи травлення було вивчено особливості характеру і ступінь ураження органів шлунково-кишкового тракту у всіх генотипових групах. У групі гомозигот у кожної другої дитини першим проявом захворювання був кишковий синдром, середній вік прояву якого по групах становив відповідно 1,4 0,3 місяця, 2,2 0,49 місяця і 3,1 1,1 місяця (p1-2<0,05; p1-3<0,05). Все це свідчить про дуже раннє втягування підшлункової залози в патологічний процес у групі гомозигот. Клінічні прояви кишкового синдрому були найбільш виразні у дітей І групи, характерною ознакою його були часті, до 8-10 разів на добу, випорожнення (подеколи - до 30) (p1-2<0,006; p1-3<0.01). Диспептичні випорожнення (рідкі або кашоподібні) вірогідно найчастіше зустрічалися в цій групі (p1-3<0,001). Вони також найчастіше відзначалися великою кількістю, були жирні та смердючі (p1-3<0,05). Збільшення живота внаслідок метеоризму і гіпотонії мязів відзначалося в цій групі у 65% дітей. Підтвердженням звязку між ступенем панкреатичної недостатності (ПН) і тяжкістю кишкового синдрому є наявність позитивної кореляції між виділенням нейтрального жиру і частотою випорожнення (R=0,62, p<0,01). Під час копрологічного досліджування наявність нейтрального жиру відзначалася в усіх обстежених дітей першої групи (Z=2,35, p1-3<0,016), наявністю жирних кислот у 72,9% (p1-3<0.05), мязових волокон (креаторея) у 54% (p<0,05). Слід зазначити, що ультразвукове дослідження підшлункової залози хворих дітей значних розбіжностей стосовно зміни її обсягу і структури не виявило. У 87% хворих дітей гомозигот за DELF508 спостерігалися різноманітні варіанти ураження органу - від незначного збільшення розмірів залози, ділянок підвищеної ехогенності до вираженого ущільнення усієї залози, причому в ранніх стадіях захворювання. Найперша і найважча ознака дисфункції залоз тонкого кишечника - меконіальный ілеус - відзначалася у 22,7% хворих дітей цієї групи (p<0,05), це збігається з даними зарубіжних авторів [A.Hamosh et al, 1991]. У 5 хворих було діагностовано атрезію тонкої кишки.
У групі дітей гетерозигот за мутацією DELF508 перший прояв захворювання на синдром порушеного травлення відзначався у кожної 5-ї дитини. Ступінь виразності кишкових проявів був також достатньо виразний у дітей цієї групи, але менш, аніж у першій групі. Під час копрологічного дослідження наявність нейтрального жиру було відзначено у 92% хворих дітей. Різні варіанти ураження підшлункової залози зустрічалися у 65% хворих, меконіальний ілеус - у 8% випадків.
Серед дітей-носіїв неідентифікованих мутацій захворювання починалося з кишкового синдрому у 30% випадків. Клінічні прояви кишкового синдрому в цій групі були найменш виразні. Оформлені випорожнення у 30% дітей найчастіше зустрічалися в цій групі. Збільшення живота було відзначено у 40%. У групі хворих дітей з неідентифікованими мутаціями під час копрологічного дослідження зміни були менш виразні. Величини таких показників як нейтральний жир, жирні кислоти і креаторея відзначалися відповідно в 84,5%, 53,8% і 30,8% випадків. У 55% хворих дітей відзначалися різні варіанти ураження підшлункової залози. Меконіальний ілеус зустрічався у 3 дітей (10%), а у одного з них генотип був G551D/x.
Підтвердженням впливу генотипу на екзокринну функцію підшлункової залози є наявність панкреатичної недостатності (ПН) у дітей, хворих на муковісцидоз, що виявляється як порушення асиміляції жиру. Клінічно це - недостатнє збільшення ваги, виразний кишковий синдромом, більш ранній початок захворювання і менша тривалість життя.
Таблиця 4. Прояв панкреатичної недостатності залежно від генотипу
Генотип ПН ПД кількість % кількість
DELF508/ DELF508 n=44 44 100,0
DELF508/ x n=37 34 91,9 3 8,1 x/ x n=30 25 83,3 5 16,7
Відповідно до аналізу клінічних ознак (таблиця 4) у хворих дітей гомозигот за DELF508 (100%) відзначається найбільш виразна ПН, що характеризується стеатореєю, діареєю, метеоризмом, і у 70% вона проявилася від народження, що підтверджено у роботах інших дослідників [L.C.Tsui et al,1997]. У групі дітей гетерозигот за МУТАЦІЄЮDELF508 виразна панкреатична недостатність відзначалася у 91,9%, у групі МВ дітей із неідентифікованими мутаціями - у 73,3% (p<0.05).
Для оцінки вивчення особливостей клінічних проявів і результатів лабораторно-інструментального обстеження органів шлунково-кишкового тракту за наявності МВ нами були визначено інтегральні перемінні для кожної генотипової групи (I - 0,73 0,02; II - 0,49 0,04; III - 0,47 0,05), коефіцієнт парної кореляції становив R=0,47, p<0,001, що свідчить про тісний звязок між генотипом - “важкі” мутації (зокрема, гомозиготи за DELF508) і ступенем панкреатичної недостатності.
При зіставленні даних ультразвукового і пальпаторного методів дослідження нами було виявлено гепатомегалію в генотипових групах обстежених дітей - у 79,2%, 46,2% і 60,0% випадках відповідно. У групі гомозигот гепатомегалія зустрічалася частіше (?2 = 7,16; p1-2<0,05). Ультразвукові ознаки холестазу (ущільнення стінок судин і жовчних проток, посилення ехогенності паренхіми) були вищі в групі гомозигот за DELF508 (?2=31,6; p1-2<0,05, p1-3<0,05); жовчнокамяну хворобу не виявлено у жодного хворого. За даними аутопсії, виконаної у 33 дітей віком від 0 до 5 років, жирову дистрофію було діагностовано у дітей в усіх групах у 41%, 40%, 33% випадків відповідно. Водночас у трьох дітей I групи мало місце поєднання дифузійної жирової дистрофії з проявами холестазу, що збігається з даними літератури [Л.М.Соколова,1990].
Під час нашого дослідження не було виявлено підвищення активності індикаторних ферментів, що характеризують структурну цілісність гепатоцитів, а також клінічних ознак і відповідних лабораторних показників печінкової недостатності, що відповідає відомому погляду стосовно нечастих її проявів за наявності муковісцидозу [Г.В.Павлов та ін., 1992; Л.В.Богданова,1988; G.Santis et al,1991]. Порівняльний аналіз результатів вивчення функціонального стану печінки виявив її зміни в 13,9% 22,6% і 16,7% випадків відповідно. Аналіз протеїнограми не виявив глибоких порушень білкової-синтетичної функції печінки, проте помірні явища диспротеінемії відзначалися в групі гомозигот у 83% хворих дітей, розбіжності статистично достовірні (p<0,05). Оцінка результатів лабораторних методів дослідження показала їхню недостатню інформативність, тоді як ультразвуковий метод дослідження є ефективним для прижиттєвої діагностики патологічних змін у печінці.
Наші дані свідчать, що тяжкість ураження гепатобіліарної системи визначається наявністю в генотипі хворої дитини двох “важких” мутацій гомозиготи за DELF508 (R=0,59; p<0,001). Це призводить до утворення більш глевкої жовчі, що сприяє появі обструкції жовчних проток і жовчного пухиря.
В усіх досліджуваних групах нами було проведено кореляційний аналіз ступеня дихальної недостатності і кількості нейтрального жиру. Кореляційного звязку цих показників не встановлено. Це свідчить про те, що бронхолегеневі порушення варіюються незалежно від панкреатичного статусу.
Остаточна фенотипова експресивність визначається не тільки ТРБМ -генотипом, а й може модулюватися як іншими генетичними чинниками, так і агентами навколишнього середовища. Слід припустити, що генотип визначає рівень фенотипової мінливості, а на формування остаточного фенотипу впливають інші чинники. Усе вищенаведене свідчить про те, що звязок між генотипом і фенотипом не є абсолютним і отже уявлення про нього не можуть бути спрощеними. Дослідження в цьому напрямку мають і надалі тривати, що сприятиме запровадженню нових методів більш раціональної терапії при цьому захворюванні.
Показники, що характеризують ступінь ураження бронхолегеневої системи і системи травлення, і клінічні спостереження свідчать, що захворювання в групі носіїв неідентифікованих мутацій протікає достатньо важко. Виходячи з цього, можна припустити наявність в Україні ще однієї мажорної “важкої” мутації. Пошуки в цьому напрямку мають тривати.
Значний дефіцит ваги тіла (менш як 3 перцентіля) встановлено відповідно за групами у 81%, 72,3% та 50% дітей (p<0,05). Відставання щодо росту (менш як 3 перцентіля) відмічалося у 64,8%, 55,9% та 42,3% обстежених відповідно. Аналіз показників фізичного розвитку за Tanner також виявив знижений показник маси тіла у всіх обстежених дітей до 73,5 2.1; 79,2 1.8, 77 0.35 відсотків та МЗІ до 80,5 1.9; 85,8 2.0; 83,6 2.6 відсотків. У дітей першої групи мало місце зниження як индесу маси, так і МЗІ (p<0.05). Корекція нутритивного стану потребує більш енергійних заходів для дітей цієї групи.
Нами проаналізовано залежність МЗІ від тяжкості та тривалості перебігу захворювання. У групі гомозигот МЗІ зменшується пропорціонально тривалості перебігу захворювання від 97% у дітей віком менше 1 року до 65% у дітей 14 літнього віку (p<0,05) У другій групі цей показник знизився з 85% у дітей віком менше одного року до 80% у дітей після 4 років (p<0,05). У третій групі відмічалося рівномірне зниження показників МЗІ в усіх вікових групах без вірогідної різниці.
В усіх генотипових групах виявлено зниження показників ВРІ залежно від тяжкості захворювання. При тяжкому перебігу (індекс Швахмана більше 40) у хворих дітей першої групи відмічено зниження показника маси до 70,7 2.2 та МЗІ до 78,8 13,4 (p<0,05). Таким чином, у групі гомозигот за DELF508 відставання дітей у фізичному розвитку вірогідно більш виражене, аніж в інших досліджених групах. Враховуючи зазначене, доцільним є застосування показників фізичного розвитку дітей для визначення ступіня тяжкості, прогнозу перебігу захворювання та оцінки ефективності лікування.
Запровадження досягнень молекулярної генетики в практику генетичного консультування і допологової діагностики відкрило нову еру у профілактиці цього важкого спадкового захворювання в родинах високого ризику народження дитини з муковісцидозом, тому що зявилася можливість діагностувати захворювання на основі ідентифікації первинного генетичного дефекту.
Було проведено генетичне консультування в 96 родинах високого ризику народження дітей із МВ із різних регіонів України з використанням результатів молекулярно-генетичних досліджень. Результати досліджень дозволили розділити ці родини на діагностично інформативні (в яких можлива ідентифікація МВ хромосом в обох батьків), напівінформативні (ідентифікується одна МВ хромосома) і неінформативні. Основний внесок в інформативність обстежених нами родин вносить мутація DELF508, що траплялася з частотою 56%; мутації R553X і G551D - в поодиноких випадках. За результатами ДНК-аналізу тестовані мутації було виявлено на обох хромосомах у 40 родинах; у 20 родинах - тільки на одній хромосомі, а інша була маркірована ПДРФ-маркером, в 7 родинах було підібрано інформативні маркери для обох хромосом. Таким чином, 67% родин були діагностично інформативні, що дозволяє проводити в них молекулярно-генетичні дослідження в повному обсязі, 14% родин були напівінформативні, можливою є ідентифікація тільки однієї МВ хромосоми або прямим тестуванням мутацій, або аналізом зчеплення маркерів ДНК. У цих родинах можливим є здійснення ДНК-аналізу для уточнення генетичного ризику та проведення допологової діагностики. І тільки 15 родин (15,5%) виявилися діагностично неінформативними. Допологову діагностику в цих родинах можна здійснити тільки визначивши ферменти навколоплідної рідини.
Повних родин високого ризику МВ (обидва батьки і дитина) було обстежено 74, із них у 71 було ідентифіковано обидві МВ - хромосоми прямою детекцією гена і сімейним ПДРФ-аналізом, у 2 родинах тільки одну хромосому була маркіровано поліморфними локусами, в одній родині їх підібрати не вдалося. Отже, діагностична інформативність в даному разі становить 95,6%, що дозволяє в сто процентах гарантувати народження здорової дитини.
Для проспективного генетичного консультування необхідним є проведення, т.зв. "каскадного", молекулярно-генетичного скринінгу мутацій серед близьких родичів пробанда, у якого вдалося ідентифікувати мутації, а також у батьків хворої дитини і їхніх партнерів при повторних шлюбах. Відсутність тестованих мутацій, в іншого партнера дозволяє модифікувати ризик гетерозиготного носійства від загальнопопуляційного 1:24 до 1:50, і ризик мати хвору дитину стає 1/50 х 1/4 = 1/200 (0,5%) за частоти мутації DELF508 56%. В даний час аналіз мутацій дозволяє допомогти близьким родичам хворого на МВ. У родичів хворих I і II ступеня кревності, у котрих DELF508 зустрічається на обох хромосомах, тобто гомозигот за цією мутацією, в разі відсутності тестованої мутації можливість мати хвору дитину з МВ практично виключена. В разі наявності у хворого на МВ тестованих мутацій на одній хромосомі, доцільно досліджувати родичів I і II ступеня кревності (сиблінгів, дядьків, тіток, кузенів і ін.). Отримані результати можна використовувати для розрахунків генетичного ризику.
На сучасному етапі стану проблеми МВ в Україні ефективним методом боротьби з ним є допологова діагностика, яка має на меті уточнення наявності у плода цього важкого спадкового захворювання. Для пренатальної діагностики цього захворювання застосовується пряма детекція гена, а також сімейний аналіз зчеплених поліморфних ДНК - маркерів із локусом гена ТРБМ. У деяких випадках не удається підібрати для родини інформативну поліморфну ДНК-систему, найчастіше через те, що нема живого пробанда, і пренатальна діагностика проводиться визначенням ферментів мікроворсинок кишечника плоду в амніотичній рідині.
У 32 родинах було проведено 43 допологові діагностики, тому що в 9 родинах були повторні вагітності (у 2 родинах по три вагітності). Одержання матеріалу для допологової діагностики проводилося за допомогою інвазивних досліджень, таких як біопсія хоріону або плаценти й амніоцентез. 43-м вагітним жінок було піддано 45 інвазивним дослідженням (у двох - по два дослідження - біопсія хоріону й амніоцентез). У першому триместрі було проведено 22 (48,9%) біопсії хоріону, у другому триместрі - 12 (26,7%) биопсій плаценти і 11 амніоцентезів (24,4%). У першому триместрі інвазивні дослідження були виконані в родинах, де генетичне консультування і планування допологової діагностики проводилося до вагітності. В 19 родинах (44,2%) було проведено прямий аналіз мутацій DELF508, в 5 родинах (11,6%) проводилося комбінування прямого аналізу з визначенням маркерів зчеплених із локусом ТРБМ. 11 родин (25,6%) потребували комбінування прямого аналізу з визначенням ферментів в амніотичній рідині, але це було виконано тільки у 2 родинах, тому що 5 вагітних жінок вирішили перервати вагітність із ризиком 50/50; в інших випадках при проведенні прямого аналізу біоптата хоріону плоди були здорові. В 8 родинах (18,6%) допологова діагностика проводилася тільки дослідженням ферментів амніотичної рідини. [Інститут акушерства і гінекології ім. Отта, м. Санкт-Петербург, лабораторія пренатальної діагностики спадкових хвороб - керівник проф. В.С. Баранов]. Після ДНК-аналізу отриманого матеріалу в 15-ти випадках у плодів було діагностовано муковісцидоз, у 5 випадках - із ймовірністю 50%, у 27 випадках плоди були здорові, серед них 16 гетерозиготних носіїв гена. В усіх випадках діагностованого муковісцидозу, за винятком однієї родини, усі вагітності було перервано. У 5 напівінформативних родинах, де ризик був 50:50, було вирішено перервати вагітністьі.
Найбільш ефективним є консультування родини і планування допологової діагностики до настання вагітності, що сприяє своєчасному і максимальному використанню усіх наявних методів допологової діагностики. Слід зазначити, що своєчасне генетичне консультування і допологова діагностика на основі результатів ДНК-аналізу позитивно впливають на репродуктивну поведінку родини.
Поєднання зусиль спеціалістів педіатричних клінік, лікарів-генетиків, молекулярних біологів, фахівців допологової діагностики в нашій роботі сприяло комплексному вирішенню проблем, що стоять перед родинами з дітьми, хворими на муковісцидоз: а) підвищення рівня розуміння батьками хворої дитини спадкової природи даного захворювання;
б) проведення ДНК-аналізу пробанду, його батькам, братам, сестрам тощо для створення банку даних носіїв гена МВ;
в) надання допомоги у подальшому плануванні родини, а також своєчасне й ефективне застосування допологової діагностики з метою профілактики цього важкого спадкового захворювання.
ВИСНОВКИ
Група гомозигот за мутацією DELF508 характеризується більш важкими клініко-функціональними респіраторними порушеннями, виникненням легеневих ускладнень (пневмоторакс у 10%, ателектаз -18%), що визначається наявністю асоціації (RA=0,19, p<0,05) між генотипом і клінічними проявами хронічного бронхолегеневого процесу.
Відзначено тісний звязок між генотипом “важкі” мутації, зокрема гомозигот за delta F508 і ступенем панкреатичної недостатності у дітей, хворих на муковісцидоз (R=0,47, p<0,001)). Аналогічна залежність спостерігається в цій групі хворих дітей стосовно фенотиповних ознак ураження гепатобіліарної системи (R=0,59; p<0,001).
В усіх генотиповних групах відзначається збільшення концентрації хлоридів потової рідини, що свідчить про істотну роль гена муковісцидозу у визначенні фенотипу потових залоз.
Антропометричні показники новонарождених із муковісцидозом такі самі як у практично здорових дітей. Надалі відбувається відставання їх у фізичному розвитку, яке найбільш виразне у групі гомозигот за DELF508. Зниження масо-зростових показників залежить від тривалості, тяжкості захворювання, терміну встановлення діагнозу і початку застосування патогенетичної терапії.
При генетичному консультуванні родин високого ризику муковісцидоза, з огляду на невисоку частоту найбільш поширених мутацій гена ТРБМ, обовязковим є використання результатів прямого і непрямого ДНК-аналізу, проведеного хворій дитині і його батькам, що підвищує діагностичну інформативність родин до 95,5%.
Ефективною профілактикою муковісцидозу в діагностично інформативних родинах є косплексне застосування прямої детекції гена і сімейного аналізу ПДРФ маркерів для ідентифікації мутантних хромосом при допологовій діагностиці захворювання, що гарантує народження здорової дитини.
ЛІТЕРАТУРА
Список опублікованих наукових праць, які відображають основні положення дисертації.
Михайлец Л.П. Муковисцидоз: генетическое консультирование и дородовая диагностика // Журнал практического врача № 2,1997, с.27 -29.
Михайлець Л.П., Антипкін Ю.Г. Асоціація генотипу з особливостями клінічних проявів змін бронхолегеневої системи при муковісцидозі у дітей // Педіатрія, акушерство та гінекологія N5, 1998 с.26-29.
Л.П.Михайлець Вплив тривалості, тяжкості перебігу муковісцидозу та типу мутації на фізичний стан хворих дітей. // Педіатрія, акушерство та гінекологія N4, 1999 с.151
Популяционный и семейный анализ ассоциации ПДРФ-маркеров с геном муковисцидоза в некоторых регионах Украины //Лившиц Л.А., Гришко В.М., Кравченко С.А., Храмов А.В., Михайлец Л.П., Бычкова А.М., Горовенко Н.Г., Гаврилюк Ю.М., Иващенко Т.Э., Баранов В.С., Бужиевская Т.М.//Второй всесоюзный съезд медицинских генетиков, Алма-Ата,1990, 4-6 декабря (Тезисы докладов), Москва, 1990, 253-254.
ДНК-анализ мутаций в гене трансмембранного белка муковисцидоза (ТРБМ) и характер их ассоциаций с полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов некоторых локусов хромосомы 7 в разных регионах Украины // Л.А. Лившиц, С.А. Кравченко, В.И. Гришко, Л.П. Михайлец, Н.Г. Горовенко, А.М.Бычкова, Т.И. Бужиевская, О.И. Ковальчук, Ю.И.Гаврилюк, В.С.Баранов // Тезисы докладов. VI съезд Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Полтава, 1992 г.), Том.I, с. 80.
Кравченко С.А., Гришко В.И., Михайлец Л.П., Сопко Н.И., Гордиенко И.Ю., Веропотвелян Н.П., Лившиц Л.А. Пренатальная диагностика некоторых наследственных заболеваний в Украине, основанная на анализе ДНК. // Ультразвукова перинатальна діагностика, 1994, № 4-5, с.90-95.
Ультразвуковое исследование органов брюшной полости при муковисцидозе у детей. // Михайлец Л.П., Бабко С.А., Антипкин Ю.Г. // Ехографія в перинатології, гінекології та педіатрії. III щорічний збірник наукових праць Української асоціації лікарів ультразвукової діагностики в педіатрії та гінекології. Кривий Ріг, 1995, с.267-268.
Михайлець Л.П., Тарапурова О.М., Лівшиць Л.А., Кравченко С.А., Марченко О.В. Допологова діагностика в сімях високого ризику народження дітей з муковісцидозом // X зїзд акушерів-гінекологів України (Тези доповідей), Одеса, 1996,с.91.
Analysis of cystic fibrosis in Ukraine /L.A.Livshits, S.Kravchenko, M. Nechiporenko, L.P.Mickhaylets, N.Sopko // DNA Extraction and Cystic Fibrosis Mutation Detection Techniques. Prague, Sept. 13-16, 1997, p.9-10.
Молекулярно-генетичний аналіз муковісцидозу в Україні // Лівшиць Л.А., Кравченко С.А., Нечипоренко М.В., Михайлець Л.П., Гарбуз Л.Б., Сопко Н.І. // Матеріали науково-практичної конференції "Сучасний стан медичної генетики в Україні" Київ, 19-20 травня 1999 р.,с.99-100.