Исследование противоопухолевой цитотоксической активности ИФН-ДК у больных с внутримозговыми глиомами, с высокой и низкой степенью злокачественности. Влияние стероидных гормонов дегидроэпиандростерона сульфата и прогестерона на активность ИФН-ДК.
Аннотация к работе
Поскольку ДК захватывают антигены путем макропиноцитоза, но не обладают способностью к фагоцитозу [Lim J.P., 2011], вполне допустимо предположить, что эффекторная функция этих клеток, как и других клеток естественного иммунитета (NK-клетки, нейтрофилы, макрофаги), связана с цитотоксическим действием на клетки-мишени. Важно отметить, что в связи с малочисленностью популяции ДК в организме для изучения свойств и клинической апробации этих клеток в качестве вакцин используют культуры дендритных клеток, генерируемых in vitro из их предшественников. Исследования показали, что интерфероны I типа и интерферон-? при краткосрочной обработке клеток in vitro могут также усиливать цитотоксическую активность стандартно генерируемых миелоидных ДК [Fanger N.A., 1999; Liu Sh., 2001]. Клетками-мишенями цитотоксической активности ДК могут быть инфицированные вирусом папилломы человека кератиноциты и клетки цервикального эпителия [Hubert P., 2001; Le Poole I.C., 2008], отличающиеся повышенной экспрессией CD40 и TRAIL-R1/R2 по сравнению с неинфицированными клетками. Изучить цитотоксическую активность ИФН-ДК против активированных Т-лимфоцитов и NK-клеток и вовлеченность отдельных сигнальных путей в реализацию данного эффекта.
Список литературы
По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных работ.
Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии НИИ Клинической иммунологии СО РАМН (руководитель лаборатории д.м.н., профессор, член-корреспондент РАМН Е.Р. Черных).
Автор диссертации выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю д.м.н., проф. Е.Р. Черных за поддержку и помощь, оказанную при работе над диссертацией. Реализация диссертационной работы была бы невозможна без всесторонней поддержки и активного участия в моделировании экспериментов к.м.н. Леплиной О.Ю., к.б.н. Сахно Л.В., к.х.н. Тихоновой М.А., а также без технической поддержки Салимовой Г.М. Всем им, а также многим другим сотрудникам НИИ клинической иммунологии СО РАМН автор выражает искреннюю признательность и благодарность.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования 120 доноров крови, выполненного за период 2008-2011 гг. Также в исследование были включены 37 больных внутримозговыми глиальными опухолями (17 мужчин и 20 женщин), которые были прооперированы и наблюдались в клинике нейрохирургии ФГУ «НИИ травматологии и ортопедии» Росздрава с 2008 по 2011гг. Средний возраст больных составил 42,3 ± 3,8 лет. Среди обследованных больных у 20 пациентов (54%) диагностировалась гистологически верифицированная глиобластома (Grade IV), у 8 пациентов (21,6%) - астроцитома (Grade III), а также у 9 пациентов (24,4%) глиальные опухоли Grade I-II (ангиоретикулема, фибрилярно-протоплазматическая астроцитома или менингиома).
Мононуклеарные клетки (МНК) из венозной гепаринизированной крови выделяли стандартным методом градиентного центрифугирования на фиколле-верографине.
Генерация IL-4-индуцированных ДК (ИЛ4-ДК). Дендритные клетки генерировали путем культивирования прилипающей фракции МНК. Для этого МНК в концентрации 3?106кл/мл помещали в 6-луночные планшеты для культивирования (TTP, Швейцария) на 2 часа в 3 мл среды RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3мг/мл L-глютамина, 5ММ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 5% сыворотки крови АВ(IV) группы. Затем неприлипшую фракцию удаляли, а оставшиеся клетки инкубировали в полной культуральной среде в присутствии GM-CSF (Sigma-Aldrich, 40нг/мл), IL-4 (Sigma-Aldrich, 40нг/мл) и 2,5% сыворотки крови плодов коровы (БИОЛОТ, Санкт-Петербург) в течение 5 суток при 37°С в СО2-инкубаторе при 5% СО2 с последующим добавлением на 48 ч в качестве дозревающего стимула ЛПС (Е.colli 0114:B4, Sigma-Aldrich, 10 мкг/мл). После чего проводился подсчет ДК, а также сбор супернатантов ДК.
Генерация IFN?-индуцированных ДК (ИФН-ДК). Прилипающую фракцию МНК (полученную как указано в предыдущем протоколе) инкубировали в полной культуральной среде в присутствии GM-CSF (Sigma-Aldrich, 40нг/мл), IFN? (Роферон-А, Roche, Швейцария 1000 Ед/мл) и 2,5% сыворотки крови плодов коровы (БИОЛОТ, Санкт-Петербург) в течение 3 суток при 37°С в СО2-инкубаторе при 5% СО2 с последующим добавлением на 24 ч в качестве дозревающего стимула липополисахарида (ЛПС Е.colli 0114:B4, Sigma-Aldrich, 10 мкг/мл). После чего проводился подсчет ДК, а также сбор супернатантов ДК в необходимых объемах для тестирования.
В отдельной серии экспериментов в культуры ДК совместно с ЛПС добавляли препараты на основе производного этиленпиперазина (5 мкг/мл), двуцепочечной ДНК человека (5 мкг/мл), а также рекомбинантного интерлейкин-2 человека (RIL-2, 50 ЕД/мл)
Влияние дегидроэпиандростерона сульфата (ДЭАС, 10-6М, Sigma-Aldrich) и прогестерона (100 нг/мл, Sigma-Aldrich) на функциональную активность ИФН-ДК оценивали, добавляя гормоны в начале культивирования (в первые сутки) или на стадии дозревания совместно с ЛПС за 24 ч до окончания культивирования.
Определение субпопуляций клеток методом проточной цитофлуориметрии. Приготовление образцов для определения относительного содержания субпопуляций ДК, экспрессирующих поверхностные CD-маркеры, проводили в соответствии с методикой Becton Dickinson. ДК (50 мкл, 0,5?106 клеток/ пробу) в растворе «А» (5% желатиноля, 0,1% азида натрия, 0,02% ЭДТА, 10% сыворотки доноров АВ (IY) группы в фосфат-забуференном физиологическом растворе) помещали в лунки 96-луночных плоскодонных планшетов. К суспензии клеток добавляли по 50 мкл FITS- или фикоэритрин (Pe)-меченных моноклональных анти-HLA-DR, -TRAIL, -FASL, -B7-H1 антител (BD PHARMINGEN, США) и инкубировали 30 мин при 4°С. Затем клетки отмывали от антител путем добавления в каждую лунку 2,5 мл раствора «А» и центрифугирования планшета при 1000 об/мин (300g) 5 мин, после чего надосадочную жидкость сливали. Затем клетки ресуспендировали в 50 мкл раствора «А» и переносили в пробирки для цитофлуориметрического анализа, содержащие 0,4 мл лизирующего раствора (FACS Lyse, Becton Dickinson, США), что обеспечивало фиксацию с полным разрушением остаточных эритроцитов.
Для определения внутриклеточной экспрессии перфорина после отмывки раствором «А» ДК инкубировали 15 мин при комнатной температуре с 5 мкл FITC-меченных моноклональных анти-HLA-DR антител (Becton Dickinson, США). Далее проводили пермеабилизацию клеток с помощью 0,2% раствора Твин-20 и инкубировали их с моноклональными анти-перфорин-антителами, конъюгированными с Ре (Becton Dickinson, США). Затем клетки ресуспендировали в 50 мкл раствора «А» и переносили в пробирки для цитофлуориметрического анализа, содержащие 0,4 мл лизирующего раствора.
Подготовленные пробы подвергали исследованию на лазерном клеточном сортере-анализаторе FACSCALIBUR (Becton Dickinson, США) с использованием программы Cell Quest (Becton Dickinson, США). Процент позитивных клеток, экспрессирующих соответствующие CD-маркеры, рассчитывался на 10000 клеток в моноцитарном регионе.
Определение цитотоксической активности ИФН-ДК
JAM-тест. Для оценки цитотоксической активности ДК клетки опухолевых линий Jurkat (T-клеточная лимфома), HEP-2 (клетки эпителиальной карциномы гортани человека) и U-87 (глиобластома человека) предварительно метили 3Н-тимидином (1 МКЮ/лунку) в течение 18 ч, отмывали и культивировали в 96-луночных планшетах (104/лунку). Эффекторные клетки (ИФН-ДК) добавляли в соотношении 40:1, 20:1 и 10:1. Через 18 ч клетки переносили на фильтры и оценивали радиоактивность на ?-счетчике (Packard Instrument, Meriden, CT). Процент цитотоксичности рассчитывали по формуле [1 - (имп/мин в культурах с эффекторными клетками/ имп/мин в контрольных культурах в отсутствие эффекторных клеток)] ? 100.
Для изучения роли отдельных сигнальных путей в реализации цитотоксической активности ДК в отдельных экспериментах ИФН-ДК предварительно инкубировали в течение 60 мин с химерными молекулами RHTNFR1/TNFRSF1A Fc chimera (10 мкг/мл), RHFAS/TNFRSF6/CD95 Fc chimera (10 мкг/мл) и RHTRAIL R2/TNFRSF10B Fc chimera (10 мкг/мл; все реактивы R&D Systems, США).
МТТ-тест. Опухолевые клетки НЕР-2, Jurkat (50?103 /лунку) культивировали с ЛПС-активированными ИФН-ДК больных и здоровых доноров в 96-луночных плоскодонных планшетах в течение 24 часов в различных соотношениях эффектор/мишень (2:1, 1:1, 1:2). За 3-4 часа до окончания инкубации в лунки вносили по 20 мкл 5 мг/мл раствора желтого бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ, Sigma-Aldrich, Германия), а затем через 3-4 часа планшеты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут, удаляли супернатант и добавляли по 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, MP Boimedicals, LLC, Франция). Через 30 минут после полного растворения пурпурно-синих кристаллов формазана измерялась оптическая плотность содержимого лунок на мультилуночном спектрофотометре (Thermo Scientific Multiskan FC, Finland) при длине волны 492 нм. Расчет цитотоксической активности (%) проводился по стандартной формуле: [1-(ОПЭ м-ОПЭ)/ОПМ] ? 100, где ОПЭ м - значение оптической плотности в опытных сериях; ОПЭ - значение оптической плотности в лунках с эффекторами; ОПМ - значение оптической плотности в лунках с мишенями.
Детекция апоптоза в опухолевых клетках. Для определения уровня апоптоза клетки НЕР-2 инкубировали в 96-луночных планшетах (104/лунку) в присутствии ЛПС-активированных ИФН-ДК в соотношении ДК:НЕР-2 10:1 в течение 18 часов. Культуры дублировали в 12 идентичных повторах с целью получения клеток в количестве, достаточном для проведения цитофлуориметрического анализа. Перед культивированием опухолевые клетки окрашивали витальным красителем CFSE (Molecular probes, USA) с конечной концентрацией 2 МКМ в RPMI-1640 в течение 15 минут, затем отмывали в RPMI-1640 с 10% FCS (БИОЛОТ, Санкт-Петербург). Анализ количества делений проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) по каналу FL1 флуоресценции CFSE с эмиссией 517 нм. Уровень апоптоза определяли с помощью ДНК-интерколирующего красителя 7-амино-актиномицина D (7-AAD, Calboichem, Israel). Результат выражали в виде процентного соотношения позитивных клеток к общему количеству в исследуемой области.
Оценка клеточного цикла и детекция апоптоза в Т-лимфоцитах и NK-клетках. Уровень апоптоза CD3 CD4 и CD3 CD8 Т-лимфоцитов, а также CD16 CD56 NK-клеток оценивали в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) при культивировании в течение 3 суток МНК доноров (0,1?106/лунку) в 96-луночных круглодонных планшетах в присутствии аллогенных ИФН-ДК в соотношении 10:1. Культуры дублировали в 12 идентичных повторах с целью получения клеток в количестве, достаточном для проведения цитофлуориметрического анализа. В отдельных экспериментах ИФН-ДК предварительно инкубировали в течение 60 мин с химерными молекулами RHTNFR1/TNFRSF1A Fc chimera (10 мкг/мл), RHFAS/TNFRSF6/CD95 Fc chimera (10 мкг/мл) и RHTRAIL R2/TNFRSF10B Fc chimera (10 мкг/мл; все реактивы R&D Systems, США).
Клеточный цикл и уровень апоптоза CD4 и CD8 (CD4-) Т-клеток и CD16 CD56 NK-клеток оценивали методом трехцветной проточной цитометрии. Для этого, 25 мкл МНК (1,0х106), полученных после культивирования в алло-СКЛ, инкубировали в течение 45 мин при 4°С в темноте с 5 мкл FITC-коньюгированных анти-CD3-антител и 5 мкл PE-коньюгированных анти-CD4 или 5 мкл FITC-коньюгированных анти-CD16-антител и 5 мкл PE-коньюгированных анти-CD56 (Сорбент, Москва). После однократной отмывки забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,02% ЭДТА и 1% азида натрия (раствор «А») клетки фиксировали в течение 30 мин холодным 0,5% раствором парафармальдегида. Фиксированные клетки центрифугировали, осадок ресуспендировали в 0,5 мл раствора А, содержащего РНКАЗУ в концентрации 20 мкг/мл, после чего клетки инкубировали в темноте в течение 30 мин при 37°C. Затем клетки обрабатывали 7-AAD (Calbiochem, Германия) в конечной концентрации 2 мкг/мл в темноте в течение 30 минут при 4°C. Анализ клеточного цикла проводили по оценке гистограмм ДНК (красная флуоресценция). Относительное содержание клеток с диплоидным (клетки в G0/G1 фазах клеточного цикла) и гипердиплоидным (клетки в S, G2/M фазах клеточного цикла) набором ДНК определяли в гейтах CD3 CD4 или CD3 CD8 (CD4-) Т-лимфоцитов (зеленая и оранжевая флуоресценция), или в гейте CD16 CD56 NK-клеток (зеленая флуоресценция). Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподиплоидный пик. Результаты выражались в виде процентного соотношения позитивных клеток к общему количеству CD3 CD4 , CD3 CD8 Т-лимфоцитов и CD16 CD56 NK-клеток (не менее 10000). В отдельных экспериментальных сериях определяли влияние нейтрализующих анти-PD-1 антител (5 мкг/мл, J116; EBIOSCIENCE) на уровень апоптоза и распределение по клеточному циклу МНК в 3-суточной алло-СКЛ.
Статистическая обработка полученных результатов. Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 6.0». Таблицы и рисунки содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (SE), медианных значений; в отдельных случаях представлены диапазоны квартильных значений. Сравнение вариационных рядов осуществлялось с помощью непараметрического U критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости pu < 0,05.
Результаты и обсуждение
Для оценки естественной противоопухолевой цитотоксической активности ИФН-ДК исследовали способность ДК лизировать опухолевые клетки линий HEP-2 (эпидермоидная карцинома гортани человека) и Jurkat (Т-клеточная лимфома), различающихся по чувствительности к TRAIL-индуцированному апоптозу. Согласно данным литературы опухолевые клетки линии Jurkat чувствительны к TRAIL- и FASL-опосредованному апоптозу [Hoves S., 2003; Lee N., 2003], тогда как линия НЕР-2 является TRAIL-резистентной [Jiang М., 2011] и слабо чувствительной к FASL-медиированному апоптозу [Morton E., 2007]. Кроме того, линия НЕР-2 является NK-резистентной [Jewett A., 2003], что позволяет исключить цитотоксический эффект, вызванный возможной примесью NK-клеток в популяции ДК. В качестве основного метода определения цитотоксической активности ДК был выбран стандартный тест с меченными 3Н-тимидином опухолевыми клетками [Hoves S., 2003].
ЛПС-стимулированные ИФН-ДК здоровых доноров обладали дозозависимой цитотоксической активностью против опухолевых клеток линий Jurkat и НЕР-2 (рис. 1А). Характерно, что цитотоксический эффект ИФН-ДК против линии Jurkat был выше, чем против линии НЕР-2 при всех соотношениях эффекторов-мишеней. Супернатанты ИФН-ДК (рис. 1Б), в отличие от самих ДК, при добавлении в дозе 30% (v/v) в культуры опухолевых клеток проявляли слабую цитотоксическую активность против клеток линии Jurkat, в среднем на уровне 13,0 ± 1,69%, и практически не оказывали цитотоксического действия против опухолевых клеток НЕР-2 (1,71 ± 0,99%).
Рис. 1. Цитотоксическая активность ЛПС-стимулированных ИФН-ДК здоровых доноров (А) и супернатантов ИФН-ДК (Б) против клеток опухолевых линий
Примечание: на рис. А представлены данные в виде средних значений (M ± SE) цитотоксической активности ДК, на рис. Б - индивидуальные значения цитотоксической активности супернатантов ДК. * - PU<0,05 -достоверность различий в соотношении 20:1. PT-T - достоверность различий по Т-тесту для независимых образцов.
Сравнительный анализ цитотоксической активности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК показал, что способность ЛПС-стимулированных ИФН-ДК лизировать клетки TRAIL-чувствительной линии Jurkat была выше в 1,8 - 2 раза при всех соотношениях эффекторов-мишеней по сравнению с ИЛ4-ДК (рис. 2А). В то же время ИФН-ДК обладали сходной c ИЛ4-ДК цитотоксической активностью против TRAIL-резистентной опухолевой линии НЕР-2 (рис. 2Б).
Рис. 2. Цитотоксическая активность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК против опухолевых клеток линий Jurkat (А) и НЕР-2 (Б)
Здесь и далее представлены данные в виде средних значений (M ± SE) цитотоксической активности ДК. * - PU<0,05 -достоверность различий между ИФН-ДК и ИЛ4-ДК.
Для того чтоб выяснить, может ли степень зрелости влиять на цитотоксическую активность ДК, был проведен анализ цитотоксической активности интактных (неактивированных) и ЛПС-стимулированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК при соотношении эффекторов-мишеней 20:1. Интактные и ЛПС-активированные ИФН-ДК и ИЛ4-ДК генерировали от одних и тех же доноров, что позволило сравнить 4 типа ДК от одного индивида. Активация ЛПС сопровождалась снижением цитотоксической активности ИФН-ДК против TRAIL-чувствительной линии Jurkat (рис. 3Б), а также ИЛ4-ДК - против TRAIL-резистентной линии НЕР-2 (рис. 3А). Кроме того, как и ЛПС-активированные, интактные ИФН-ДК так же обладали более высокой цитотоксичностью против Jurkat по сравнению с аналогичными типами ИЛ4-ДК.
Рис. 3. Цитотоксическая активность различной степени зрелости ИФН-ДК и ИЛ4-ДК здоровых доноров против опухолевых линий НЕР-2 (А) и Jurkat (Б)
В то же время добавление ЛПС в культуры ИФН-ДК и ИЛ4-ДК в целом по группам значимо не влияло на уровень их цитотоксической активности против опухолевых клеток линии НЕР-2 и Jurkat, соответственно. Однако при индивидуальном анализе было выявлено, что активация ИФН-ДК ЛПС могла вызывать оппозитные эффекты, т.е. усиливать и ингибировать цитотоксическую активность против НЕР-2. Так, в 60% (6/10) случаев добавление ЛПС в культуры ИФН-ДК сопровождалось снижением цитотоксической активности против НЕР-2 в среднем в 2,5 раза (с 19,4 ± 1,9% до 7,7 ± 2,4%), в остальных 40% случаев цитотоксическая активность возрастала (в среднем с 8,5 ± 2,4% до 21,3 ± 6,0%). Направленность эффекта была сопряжена с исходным уровнем цитотоксической активности ДК. Можно предположить, что генерированные in vitro ИФН-ДК характеризовались функциональной гетерогенностью, обусловленной соотношением ДК с различной степенью зрелости. Эта гетерогенность, по-видимому, и определяла различную направленность эффекта ЛПС на цитотоксическую активность ИФН-ДК.
Рис. 4. Влияние ЛПС-стимулированных ИФН-ДК здоровых доноров на уровень апоптоза в опухолевых клетках линии НЕР-2
Представлены данные 4-х отдельных экспериментов
Чтобы выяснить, связано ли разрушение опухолевых клеток с индукцией апоптоза, был проведен анализ клеточного цикла опухолевых клеток линии НЕР-2, предварительно меченных витальным красителем CFSE (рис. 4). Совместное культивирование CFSE-меченных клеток НЕР-2 с ЛПС-стимулированными ИФН-ДК при соотношении эффекторов-мишеней 10:1 в 4-х отдельных экспериментах сопровождалось почти трехкратным увеличением количества опухолевых клеток в фазе апоптоза в среднем с 14,5 ± 3,18% до 39,0 ± 5,15%. Таким образом, киллерный эффект ИФН-ДК опосредовался через запуск программированной гибели опухолевых клеток.
Учитывая эти данные, на следующем этапе представлялось важным исследовать, посредством каких механизмов реализуется цитотоксический эффект ИФН-ДК против опухолевых клеток. Для этого был проведен анализ экспрессии различных проапоптогенных молекул в культурах ИФН-ДК.
ИФН-ДК экспрессировали на мембране молекулы TRAIL, FASL, а также содержали внутриклеточно молекулу перфорина (табл.1). Кроме того, в культурах ИФН-ДК определялось почти 40% клеток, экспрессирующих на мембране молекулу B7-H1, которая является лигандом для рецептора смерти PD-1. Таким образом, ИФН-ДК экспрессировали достаточно широкий набор молекул, обладающих проапоптогенной активностью.
Табл. 1. Экспрессия поверхностных и внутриклеточных проапоптогенных молекул ЛПС-стимулированными ИФН-ДК
Показатель N M ± SE, % Median (LQ-UQ), %
TRAIL ДК 19 9,4 ± 1,2 8,0 (5,0 - 12,0)
FASL ДК 23 19,4 ± 2,0 15,0 (11,0 - 25,0)
B7-H1 ДК 15 38,6 ± 4,5 38,0 (28,0 - 47,0)
Perforin ДК 8 6,5 ± 1,6 4,5 (3,5 - 9,5)
Примечание: представлены средние (M ± SE, %), медианные (Median, %) и диапазон квартильных (LQ-UQ, %) значений, N - количество наблюдений.
Согласно данным литературы, IFN? оказывает стимулирующее действие на экспрессию молекулы TRAIL [Fanger N.A., 1999]. Кроме того, как выше было продемонстрировано, ИФН-ДК обладают более высокой цитотоксической активностью против TRAIL-чувствительной линии Jurkat по сравнению с ИЛ4-ДК. Для того чтобы выяснить, связаны ли выявленные различия цитотоксической активности ДК с изменением экспрессии TRAIL, на следующем этапе был проведен сравнительный анализ экспрессии мембранной формы TRAIL в популяциях интактных и ЛПС-активированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК.
Рис. 5. Экспрессия TRAIL на ИЛ4-ДК и ИФН-ДК
Представлены средние (M ± SE, %) значения относительного количества ДК, экспрессирующих TRAIL.
Активация ИФН-ДК и ИЛ4-ДК ЛПС сопровождалась тенденцией к снижению экспрессии TRAIL (рис. 5). Также следует отметить, что как интактные, так и ЛПС-активированные ИФН-ДК содержали почти в 2 раза большее количество TRAIL-позитивных клеток по сравнению с аналогичными культурами ИЛ4-ДК. Таким образом, продемонстрированная выше более высокая (в сравнении с ИЛ4-ДК) цитотоксическая активность интактных и ЛПС-активированных ИФН-ДК против TRAIL-чувствительных мишеней ассоциировалась с более высокой экспрессией ИФН-ДК молекулы TRAIL.
В отношении TRAIL-резистентных клеток-мишеней, которыми являются большинство солидных опухолей [Griffith T.S., 1998; Kim K., 2000; Eggert A., 2001], литературные данные об их чувствительности к различным цитотоксическим молекулам немногочисленны. В связи с этим следующий этап исследования был посвящен изучению возможных сигнальных путей, опосредующих цитотоксическую активность ИФН-ДК против TRAIL-резистентной линии НЕР-2. С этой целью была проведена серия экспериментов с предварительной часовой обработкой ЛПС-стимулированных ИФН-ДК растворимыми формами рецепторов к лигандам, относящимся к TNF семейству (рис. 6). Предварительная обработка TNFR1:Fc ИФН-ДК приводила практически к полному блокированию цитотоксической активности против клеток опухолевой линии НЕР-2 (в среднем на 88%), тогда как добавление растворимой формы TRAILR2:Fc и Fas:Fc не подавляло киллерную активность ДК. Таким образом, полученные данные подтверждают резистентность клеток НЕР-2 к TRAIL и FASL-медиируемому апоптозу и свидетельствуют о том, что лизис клеток НЕР-2 опосредуется с вовлечением TNF?/TNF-RI сигнального пути.
Рис. 6. Нейтрализация цитотоксической функции ДК растворимыми формами R:Fc, специфичными для лигандов, относящихся к TNF-семейству
Представлены данные в виде средних значений (M ± SE) цитотоксической активности ДК при соотношении ДК:НЕР-2 20:1. * PU< 0,01- достоверность различий между контрольной группой ДК в отсутствии R:Fc (0) и ДК в присутствии TNFR1:Fc.
Учитывая тот факт, что супернатанты ИФН-ДК не обладают киллерной активностью против клеток НЕР-2, можно предположить, что цитотоксичность ДК обусловлена трансмембранной формой TNF?, которая, согласно данным литературы, также может взаимодействовать с TNF-R1 [Horiuchi T ., 2010].
Для того чтобы выяснить возможное значение цитотоксической активности ДК в противоопухолевой защите, было проведено сравнительное исследование цитотоксичности ИФН-ДК здоровых доноров и больных глиальными опухолями головного мозга. При индивидуальной оценке цитотоксической активности ЛПС-стимулированных ИФН-ДК в соотношении эффекторы:мишени 20:1 группа больных характеризовалась достаточно высокой гетерогенностью по данному параметру (рис. 7). Так, у 25 из 37 пациентов (68%) цитотоксическая активность ИФН-ДК против опухолевых клеток НЕР-2 практически полностью отсутствовала, тогда как у 12 пациентов (32%) оставалась относительно сохранной. Учитывая неоднородность больных по гистологическим типам опухолей головного мозга, было проведено разделение больных на подгруппы в зависимости от степени злокачественности глиальных опухолей. Первую подгруппу (n=9) составили пациенты с низкой степенью злокачественности (Grade I-II) с такими вариантами опухолей, как ангиоретикулема, фибрилярно-протоплазматическая астроцитома или менингиома. Вторая подгруппа включала 28 больных с высокой степенью злокачественности (Grade III-IV), в т.ч. 8 пациентов с анапластической астроцитомой и 20 пациентов с глиобластомой. Проведенный анализ пациентов с учетом гистологического варианта опухоли показал (рис. 8), что ИФН-ДК больных с высокой степенью злокачественности (Grade III-IV) обладали очень слабой цитотоксической активностью во всех исследуемых соотношениях эффекторов-мишеней. В то же время ИФН-ДК пациентов с опухолями низкой степени злокачественности (Grade I-II) сохраняли способность к дозозависимому лизису клеток HEP-2 на уровне значений цитотоксической активности ИФН-ДК доноров.
В отдельной серии экспериментов был также проведен сравнительный анализ цитотоксической активности ДК больных с высокой степенью злокачественности опухоли (Grade III-IV) против TRAIL-чувствительной линии Jurkat (рис. 9). Обращает на себя внимание тот факт, что ДК больных, неспособные лизировать клетки линии НЕР-2, эффективно лизировали клетки линии Jurkat. Более того, цитотоксическая активность ИФН-ДК больных против клеток Jurkat была даже повышенной по сравнению со здоровыми донорами (50,43 ± 6,51% vs. 37,65 ± 4,98%, соответственно).
Рис. 9. Цитотоксическая активность ИФН-ДК здоровых доноров и больных опухолями головного мозга против клеток линии Jurkat в МТТ-тесте
Оценка цитотоксической активности ДК проводилась при соотношении ДК:Jurkat 1:1.
Рис. 10. Кривые выживаемости больных опухолями головного мозга с сохранной и сниженной цитотоксической активностью ИФН-ДК
10,3% - нижняя граница квартильного диапазона цитотоксической активности ИФН-ДК здоровых доноров.
Сравнение показателей выживаемости у больных с сохранным и сниженным уровнем цитотоксической активности ИФН-ДК против клеток HEP-2 (рис. 10) показало, что пациенты со сниженной цитотоксической активностью (10,3%), к которой были отнесены 5 больных с Grade I-II и 4 - с Grade III, все пациенты к моменту проведения анализа были живы, а средний срок наблюдения составил 38,9 ± 9,5 месяцев.
Таким образом, низкая цитотоксическая активность ДК является характерным признаком пациентов с опухолями головного мозга наиболее высокой степени злокачественности и ассоциирована с низкими показателями выживаемости. При этом практически полное отсутствие цитотоксической активности в культурах клеток НЕР-2 и повышенная цитотоксическая активность против TRAIL-чувствительных мишеней свидетельствует о селективном характере дефектности ИФН-ДК. Выявленное нарушение эффекторной функции ДК может ослаблять противоопухолевый ответ и являться одной из причин несостоятельности противоопухолевой защиты у больных со злокачественными опухолями головного мозга. В этой связи представлялось важным исследовать возможные способы коррекции цитотоксической функции ИФН-ДК у больных с внутримозговыми глиальными опухолями высокой степени злокачественности. В качестве потенциальных модуляторов были выбраны иммуноактивные препараты на основе сополимера N-окси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиния бромида (СЭП), двуцепочечной ДНК человека (ДГД) а также рекомбинантного интерлейкин-2 человека (RIL-2). Для оценки влияния иммуноактивных факторов на цитотоксический потенциал ДК больных на данном этапе был применен МТТ-тест. Цитотоксическая активность ДК больных глиальными опухолями высокой степени злокачественности против клеток линии НЕР-2, детектируемая в данном тесте, была также существенно ниже, чем у доноров.
Добавление перечисленных препаратов в культуры ИФН-ДК на этапе конечного созревания усиливало исходно низкий уровень цитотоксической активности ДК против клеток НЕР-2 практически у всех больных (рис. 11). Тем не менее, наиболее выраженной способностью к восстановлению цитотоксической активности ДК больных обладал RIL-2.
Рис. 11. Влияние иммуноактивных факторов на цитотоксическую активность ИФН-ДК больных опухолями головного мозга в МТТ-тесте
* - PU<0,05 -достоверность различий между интактными ИФН-ДК больных (0) и ИФН-ДК больных, культивированными в присутствии СЭП, ДГД или RIL-2, при соотношении ДК:НЕР-2 1:1. Вертикальная линия - среднее значение цитотоксичности ИФН-ДК здоровых доноров.
Наряду с цитокинами и другими иммуноактивными медиаторами регуляция функций ДК может осуществляться с вовлечением гормонов. Так, согласно данным литературы, гормон коры надпочечников дегидроэпиандростерон сульфата (ДЭАС) оказывает стимулирующее действие на дифференцировку и созревание ДК [Селедцова Н.В., 2007; Черных Е.Р., 2009]. В то же время прогестерон подавляет созревание ДК, индуцируя толерогенные свойства ДК [Jones L.A, 2010; Xu Y., 2011]. Можно предположить, что цитотоксическая активность ДК также подвержена гормональной регуляции.
Проведенные исследования показали (рис. 12А), что добавление ДЭАС в дозе 10-6М или прогестерона в дозе 100нг/мл на этапе конечного созревания совместно с ЛПС (за 24 ч до окончания культивирования) в культуры ИФН-ДК достоверно снижало цитотоксическую активность ДК против линий HEP-2 и Jurkat. В то же время добавление ДЭАС на этапе дифференцировки (т.е. с первых суток культивирования) сопровождалось умеренным, но значимым усилением цитотоксической активности ДК против клеток линии НЕР-2 (в среднем с 23,8 ± 1,8% до 28,9 ± 1,9%), однако не влияло на цитотоксическую активность ДК в культурах клеток Jukat (рис. 12Б). Прогестерон на этапе дифференцировки не оказывал значимого влияния на цитотоксическую активность ИФН-ДК против клеток НЕР-2 и Jurkat.
Рис. 12. Цитотоксическая активность ИФН-ДК, обработанных ДЭАС и прогестероном на этапе конечного созревания (А) и на этапе дифференцировки (Б)
Оценка цитотоксической активности ДК проводилась при соотношении ДК:опухолевые клетки 20:1. * - PU<0,05 -достоверность различий между интактными и гормон-модифицированными ИФН-ДК.
Таким образом, полученные результаты о гормон-опосредованной регуляции цитотоксичности ИФН-ДК могут представлять интерес как в плане раскрытия новых механизмов гормональной регуляции естественной киллерной активности ДК при различных физиологических и патологических состояниях, так и в аспекте направленной регуляции цитотоксической функции ИФН-ДК in vitro при проведении клеточной терапии.
Согласно данным литературы, наряду с опухолевыми клетками рецепторы к различным цитотоксическим лигандам экспрессируют активированные Т-лимфоциты и NK-клетки [Gupta S., 2005; Jeremias I., 1998; Mirandola P., 2004]. Можно предположить, что клетки иммунной системы могут выступать в качестве потенциальных мишеней цитотоксической активности ИФН-ДК. В этом случае, цитотоксическая активность ДК против Т-лимфоцитов и NK-клеток в физиологических условиях может являться одним из механизмов ограничения иммунного ответа, а при патологии - выступать в качестве одного из механизмов иммунодепрессии. В связи с этим на заключительном этапе работы было проведено исследование цитотоксического эффекта ИФН-ДК против Т-лимфоцитов и NK-клеток.
Рис. 13. Влияние ИФН-ДК на апоптоз CD4 и CD8 Т-лимфоцитов и NK-клеток
* - PU<0,05 - достоверность различий по сравнению с контролем (МНК).
Как видно из данных рисунка 13, стимуляция МНК аллогенными ИФН-ДК сопровождалась более чем 3-кратным возрастанием уровня апоптоза CD3 CD4 и CD3 CD8 Т-лимфоцитов, а также CD16 CD56 NK-клеток в 3х-суточных культурах по сравнению с относительным количеством апоптотических лимфоцитов среди нестимулированных МНК.
Для того чтобы оценить возможное участие различных сигнальных путей в индукции апоптоза лимфоцитов при их взаимодействии с ДК, была проведена серия экспериментов с использованием растворимых форм рецепторов к лигандам TNF-семейства (рис. 14). Предварительная обработка ДК химерными рецепторами TRAILR2:Fc, TNFR1:Fc и Fas:Fc приводило к достоверному снижению относительного количества CD3 CD4 Т-клеток в фазе апоптоза в среднем на 20-25%. В то же время снижение уровня апоптоза среди популяции CD8 Т-лимфоцитов наблюдалось только при блокировании TNF?-опосредованного пути добавлением TNFR1:Fc к ДК (в среднем на 24%). Таким образом, цитотоксический эффект ИФН-ДК против CD4 и CD8 Т-лимфоцитов реализуется с вовлечением различных сигнальных путей.
Рис. 14. Влияние растворимых форм R:Fc, специфичных для лигандов TNF- семейства, на способность ИФН-ДК индуцировать апоптоз CD4 и CD8 Т-клеток в СКЛ
*- PU<0,05 - достоверность различий по сравнению с контролем (МНК ДК).
Согласно данным литературы запуск программы апоптоза Т-лимфоцитов может также осуществляться через B7-H1/PD1-сигнальный путь. Для того чтобы проверить предположение об участии B7-H1/PD-1-сигнального пути в индукции апоптоза клеток иммунной системы при их взаимодействии с ДК, была проведена серия экспериментов с использованием блокирующих анти-PD-1 антител (рис. 15). Оценка клеточного цикла Т-лимфоцитов показала, что добавление нейтрализующих анти-PD-1 антител в СКЛ, индуцированную аллогенными ИФН-ДК, приводило к достоверному снижению количества CD3 CD4 и CD3 CD8 Т-лимфоцитов в фазе апоптоза в среднем в 2 и 1,8 раза, соответственно, по сравнению с контролем (в отсутствие нейтрализующих антител).
Рис. 15. Влияние анти- PD-1 антител на уровень апоптоза Т-лимфоцитов и NK-клеток в СКЛ, индуцированной ДК здоровых доноров
*-PU<0,05 - достоверность различий показателей в отсутствии и в присутствие антител против PD-1.
Оценка влияния нейтрализующих анти-PD-1 антител на уровень апоптоза в популяции NK-клеток в присутствии ИФН-ДК (рис. 15) выявила тенденцию к снижению уровня апоптоза в популяции CD16 CD56 NK-клеток (PU=0,18), что может указывать на возможное участие B7-H1/PD-1 сигнального пути в реализации цитотоксической активности ИФН-ДК против активированных NK-клеток.
Таким образом, можно заключить, что ИФН-ДК здоровых доноров обладают противоопухолевой цитотоксической активностью, которая ассоциируется с экспрессией ДК достаточно широкого спектра проапоптогенных молекул. В основе цитотоксического эффекта ДК лежит запуск программированной гибели опухолевых клеток. При этом цитотоксический эффект против TRAIL-резистентных мишеней требует контакта, а против TRAIL-чувствительных клеток опосредуется с участием растворимых факторов. ИФН-ДК отличаются от ИЛ4-ДК более высокой цитотоксической активностью против TRAIL-чувствительных опухолевых клеток, что сопряжено с более высоким уровнем экспрессии TRAIL. В то же время ведущую роль в реализации цитотоксической активности ИФН-ДК против TRAIL-резистентных мишеней НЕР-2 играет TNF?/TNF-R1-сигнальный путь.
Киллерная активность ИФН-ДК против TRAIL-резистентных клеток НЕР-2 существенно снижена у больных внутримозговыми глиальными опухолями высокой степени злокачественности, что свидетельствует о нарушении TNF?-медиируемого апоптоза у данной группы больных. Однако выявленная у больных глиальными опухолями высокой степени злокачественности дисфункция ИФН-ДК частично восстанавливается под действием различных иммуноактивных факторов. Кроме того, естественная киллерная активность ИФН-ДК подвержена влиянию стероидных гормонов - ДЭАС и прогестерона.
Цитотоксическая активность ИФН-ДК здоровых доноров может быть направлена против активированных Т-лимфоцитов и NK-клеток. При этом индукция апоптоза лимфоцитов при их взаимодействии с ДК реализуется с вовлечением молекул семейства TNF (TRAIL, TNF? и FASL) и B7-H1. CD4 и CD8 Т-клетки различаются по чувствительности к проапоптогенным молекулам TNF-семейства, но обладают сходной чувствительностью к PD-1/B7-H1-медиируемому апоптозу, который вносит наиболее существенный вклад в реализацию цитотоксической активности ИФН-ДК против обоих типов Т-клеток, а также активированных NK-клеток.
ВЫВОДЫ
Генерируемые в присутствие интерферона-? ДК экспрессируют различные проапоптогенные молекулы (трансмембранные лиганды TRAIL, FASL и В7-Н1, перфорин) и характеризуются дозозависимым цитотоксическим эффектом против клеток TRAIL-чувствительных и TRAIL-резистентных опухолевых линий, что свидетельствует о наличии противоопухолевой цитотоксической активности ИФН-ДК.
ИФН-ДК характеризуются более высокой экспрессией TRAIL и более выраженной цитотоксической активностью против клеток Jurkat, что свидетельствует об их более высоком противоопухолевом потенциале в отношении TRAIL-чувствительных мишеней по сравнению с ИЛ4-ДК.
Цитотоксический эффект ИФН-ДК в культурах TRAIL-резистентных клеток HEP-2 обусловлен индукцией апоптоза и опосредуется с участием TNF?, на что указывает практически полная отмена литического эффекта ДК при блокировании TNF/TNF-R1-сигнального пути.
ИФН-ДК больных внутримозговыми опухолями высокой степени злокачественности характеризуются сниженной цитотоксической активностью против TRAIL-резистентных мишеней и сохранной цитотоксической активностью против TRAIL-чувствительных мишеней, что свидетельствует о нарушении TNF?-опосредованного механизма цитотоксичности ДК и обосновывает возможность оценки киллерной функции ДК в качестве диагностического маркера степени злокачественности и предиктора выживаемости у больных злокачественными глиомами.
Препараты на основе производного этиленпиперазина, двуцепочечной ДНК человека и рекомбинантного интерлейкин-2 при культивировании с ИФН-ДК in vitro восстанавливают исходно низкую цитотоксическую активность ДК больных глиобластомой, что демонстрирует принципиальную возможность коррекции цитотоксической активности ДК у больных злокачественными глиомами.
ДЭАС на этапе дифференцировки ИФН-ДК стимулирует цитотоксическую активность ДК против TRAIL-резистентных клеток HEP-2, тогда как на этапе созревания аналогично прогестерону подавляет цитотоксическую функцию ДК против TRAIL-резистентных и TRAIL-чувствительных клеток-мишеней, что свидетельствует о гормональной регуляции эффекторной функции ДК.
ИФН-ДК обладают цитотоксической активностью против активированных Т-лимфоцитов и NK-клеток, которая реализуется с участием B7-H1/PD-1 сигнального пути и, в меньшей степени, - молекул TRAIL, FASL и TNF?. При этом участие всех трех лигандов семейства TNF в реализации цитотоксического эффекта ДК против CD4 Т-лимфоцитов и вовлечение только TNF?/TNF-R-сигнального пути в индукции апоптоза CD8 Т-лимфоцитов свидетельствует о различной чувствительности Т-клеточных субпопуляций к цитотоксическому эффекту ДК.
СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Тыринова Т.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Эффект дегидроэпиандростерона сульфата на созревание и функциональные свойства ИФН?-индуцированных дендритных клеток // БЭБИМ. - 2009. - Т.148, №7. - С.80-84.