Ензимно-кінетичне визначення фосфорорганічних отруйних сполук з використанням індикаторних реакцій окиснення 3,3",5,5"-тетраметилбензидину та п-фенетидину - Автореферат

Більшість методів визначення активності холінестерази зводяться до визначення кількості утворених продуктів ферментної реакції - оцтової кислоти або холіну, є лабораторними і мають суттєві обмеження у несубстратній вибірковості до кислотних та основних домішок та точності. Відомий фотометричний метод визначення активності холінестерази за кількістю невитраченого у реакції субстрата ацетилхоліну (метод Хьостріна) не дозволяє використовувати кінетичний метод, бо вимагає зміни РН реакційного середовища в ході аналізу. Разом з тим, проведення аналізу в буферованому розчині дозволить виключити заважаючий вплив домішок кислотного та основного характеру, а виконання визначення інгібіторів холінестерази у кінетичному варіанті - дозволить покращити метрологічні характеристики біохімічного методу аналізу. Дисертаційна робота виконувалася згідно науково-дослідної тематики кафедри бойових токсичних хімічних речовин та засобів захисту факультету радіаційного, хімічного, біологічного захисту та екології Харківського гвардійського ордена Червоної Зірки інституту танкових військ імені Верховної Ради України Національного технічного університету “Харківський політехнічний інститут” і є складовою частиною науково-дослідної роботи “Розробка методики визначення питомої активності холінестераз для покращення якості проведення екологічного моніторингу хімічно небезпечних обєктів”, замовником якої є Головнокомандувач Сухопутних Військ Збройних Сил України. Також дисертаційна робота виконувалася згідно науково-дослідної тематики кафедри фізичної, колоїдної та неорганічної хімії Національного фармацевтичного університету і є складовою держбюджетної теми “Хімічний синтез, виділення та аналіз нових фармакологічно-активних речовин, встановлення звязку “структура - дія”, створення нових лікарських препаратів” (№ 198U007011).Оптимальним умовами проведення реакції Шенеманна з ТМБ в присутності хлорофосу, метафосу, трихлорметафосу та фозалону є: РН 11,0 (розчин NAOH), концентрація гідроген пероксиду 10-1 М, ТМБ 2?10-3М, для запобігання випадіння осаду основи ТМБ у реакційну суміш додавали етанол з розрахунку, щоб кінцева концентрація у розчині становила 40 %(об). Результати вивчення залежності кінетики реакції окиснення ТМБ гідроген пероксидом у присутності та у відсутності хлорофосу показали, що утворення забарвленого продукту реакції досягає максимуму на 5 хв і у подальшому зменшується, ймовірно, пероксифосфатна кислота, утворена в реакції хлорофосу з гідроген пероксидом, піддається подальшій послідовній реакції пергідролізу з Н2О2, а відтак - призводить до руйнування продукту окиснення ТМБ. Ферментна реакція гідролізу ацетилхоліну перебігає за наступною схемою: Визначення ступеню інгібування фермента холінестерази у реакції гідролізу ацетилхоліну здійснювали за швидкістю реакції окиснення ТМБ пероксіоцтовою кислотою, яка утворюється у реакції непрореагованого ацетилхоліну з гідроген пероксидом: Ймовірно, пероксіоцтова кислота окиснює ТМБ за наступною схемою: Дві молекули 3,3?,5,5?-тетраметилдифенохінондиіміну, що утворилися, конденсуються з утворенням азометинового барвника - біс-(2,5,7,10-тетраметил-6-аміно)-азобіфенілу, забарвленого у жовтий колір (?max=422 нм): Опрацьовано нову методику кількісного визначення інгібіторів холінестераз у водних розчинах за принципом: “Концентрація інгібітора - швидкість утворення забарвленого продукту”. Паралельно виконували так звану “фонову реакцію” - за відсутності інгібітора: у пробірку вносили 2,0 мл 0,2 М фосфатного буферного розчину, 0,5 мл 4 мг/мл розчину холінестерази, додавали води із розрахунку 16,6-х мл (де х - загальний обєм реагентів) і 1,0 мл 5,4•10-3 М розчину ацетилхоліну, вмикали секундомір, розчин перемішували шляхом перевертання пробірки і термостатували при 37 0С протягом 10 хв. Реакція гідролізу АХ перебігає за наступною схемою: Визначення ступеню інгібування фермента ХЕ у реакції гідролізу АХ виконували за швидкістю індикаторної реакції окиснення ПФ пероксіоцтовою кислотою, яка утворюється у реакції непрореагованої кількості ацетилхоліну з гідроген пероксидом у попередній стадії аналізу: Схема окиснення ПФ пероксіоцтовою кислотою до забарвленого азоксифенетолу (?max= 358 нм) має вигляд: Результати експериментів дозволили опрацювати нову методику кількісного визначення інгібіторів ХЕ у водних розчинах за принципом: “Концентрація інгібітора - швидкість утворення забарвленого продукту”.В результаті проведених кінетичних досліджень нових реакцій окиснення 3,3?,5,5?-тетраметилбензидину та п-фенетидину гідроген пероксидом в присутності субстрату фермента холінестерази - ацетилхоліну показано можливість застосування їх як індикаторних під час визначення фосфорорганічних отруйних сполук антихолінестеразної дії біохімічним методом. Основні наукові та практичні результати роботи можна сформулювати у вигляді таких узагальнюючих висновків: 1. Опрацьовані селективні методики та показана можливість ензимно-кінетичного визначення ГД-7 (О-етиловий-S-?-етилтіоетиловий етер метилфосфонової кислот

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ